論文名稱:

Tid1,為一佐監護蛋白(cochaperone)及腫瘤抑制器,結合受質蛋白之鑑定

 

Identification of substrate proteins interact with Tid1,

 

a cochaperone and tumor suppressor

研究生:

黃律穎  Lu-Ying Huang

 

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指導教授:

羅正汎  Jeng-Fan Lo

學位類別(Degree):

碩士

學校名稱(School):

國立陽明大學

系所名稱(Department):

口腔生物研究所

學號(Student Number):

39517007

學年度(Academic Year):

96

語文別(Language):

中文

出版年(Thesis Year):

97

關鍵字:

佐監護蛋白  Tid1

 

腫瘤抑制器  cochaperone

全文說明(Fulltext description):

(本論文 20130819 對校內公開)

  論文頁數(Page):

94

摘要:

Tid1﹐果蠅腫瘤抑制蛋白Tid56之哺乳類同源蛋白﹐皆屬DnaJ familycochaperoneTid1具有兩種不同裁切方式的形式 (alternatively splicing isoform) , 長型 (Tid1-longTid1-L) 和短型 (Tid1-shortTid1-S) Tid1之胺基端 (N-terminal) 具粒腺蛋白的訊號序列 (consensus mitochondrial processing sequence) Tid1可在粒線體大量表現,亦可在細胞質及細胞核。Tid1cochaperones,在粒線體中幫助chaperone執行蛋白質摺疊。Tid1之胺基端演化高度保留結構,DnaJ domain,和Heat shock protein70( Hsp70 ) ATPase domain結合。其酸端 (C-terminal) 具高度變化性,和不同受質( substrate )結合。先前研究發現Tid1會和Ras GTPase-activating Protein (RasGAP)Janus kinase2( JAK2 )interferon-γreceptor subunit (IFN-γR2)Human T cell leukemia virus type 1 TaxIκB kinase β (IKKβ)ErbB-2結合,進而影響Rasinterferon,和NF-κB等的訊息傳導路徑。

 

本論文以定點突變法(site-directed mutagenesis)Tid1Hsp70結合的DnaJ domain HPD loop突變,以免疫共同沉澱法(co-immunoprecipitation)wild type Tid1相比較,確認mutant Tid1失去和mtHsp70結合的能力。於細胞內過量表現C-terminalHA(Influenza Hemagglutinin) tag標定之wild typemutant Tid1,進而以親和層析法(affinity chromatography)純化Tid1蛋白複合物。經SDS-PAGE後銀染(silver stain)顯見Tid1-LwtTid1-Lmut

 

Tid1-SwtTid1-Smut蛋白複合物之差異。以質譜儀(mass spectrometry)鑑定且相互比較找尋mutant Tid1特異性結合蛋白,即為非透過Hsp70Tid1結合之受質蛋白。本論文目的即希望藉研究Tid1結合蛋白,明確找出Tid1在生理上,訊息傳遞途徑,癌症生成過程中之角色。

 

 

 

Tid1 is a mammalian homolog of the Drosophila tumor suppressor Tid56. Both Tid1 and Tid56 are the members of the DnaJ protein family of proteins. DnaJ proteins act as cochaperones and specificity factors for DnaK proteins and their eukaryotic homologs, the Hsp70 family. The N-terminal region of Tid1 contains a highly conserved structure, DnaJ domain, which is the major region that binds the DnaK domain of Heat shock protein 70 (Hsp70). Others have reported that the C-terminal region of Tid1 has been identified for binding with different substrates because of its highly variability. Previous studies have shown that Tid1 binds with Ras GTPase-activating Protein (RasGAP), Janus kinase2( JAK2 ), interferon-γreceptor subunit (IFN-γR2), Human T cell leukemia virus type 1 Tax, IκB kinase β (IKKβ) and ErbB-2. Further, the binding between Tid1 and its substrates affects intracellular signaling such as Ras, interferon and NF-κB pathways.

 

  In this research, I mutated the HPD loop of DnaJ domain on Tid1, which binds with the DnaK domain of Hsp70, with site-directed mutagenesis. Wild type Tid1 with the full function of DnaJ domain could bind with mtHsp70, whereas mutant Tid1 without the function of DnaJ domain could not bind with mtHsp70 in coimmnuoprecipitation analyses. Through HA affinity chromatography I can identify other substrate proteins that specifically interact with Tid1 lacking the functional DnaJ domain. The SDS-PAGE analyses with silver stainning differentiate the difference of substrate proteins between wild type and mutant Tid1, as for long form versus short form. Further identification of the specific substrate proteins of Tid1 was conducted by affinity chromatography plus mass spectrometry. With the identified substrate proteins to Tid1, we can further elucidate the mechanism mediated by Tid1 on cellular signalling and tumorigenesis.

 

 

論文目次
Table of Content
:

頁次

 

英文縮寫6

 

中文摘要8

 

英文摘要9

 

壹、    緒論10

 

一、tid1/Tid1之介紹10

 

        1-1.源起10

 

        1-2.Tid5610

 

        1-3.Tid1的發現10

 

        1-4.tid1的基因結構(genomic structure)11

 

        1-5.Tid1蛋白各個domain的功能性介紹11

 

        1-6.Chaperone cycle.12

 

        1-7.Tid1之生理功能13

 

        1-8.mTid1及其結合之受質蛋白質14

 

        1-9.hTid1和腫瘤生成(tumorigenesis)的關係16

 

二、    以蛋白質體學研究Tid1結合之受質蛋白17

 

        2-1.蛋白質體學於現今研究上的重要性17

 

        2-2.在高等真核生物中看蛋白質間交互作用18

 

        2-3.找尋標的蛋白質的方法18

 

        2-4.分析標的蛋白質的方法19

 

貳、研究目標20

 

參、研究材料與方法21

 

    一、聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reactionPCR)24

 

    二、定點突變(site-directed mutagenesis)24

 

    三、膠體電泳(gel electrophoresis)24

 

    3-1.    DNA洋菜瓊酯電泳(agarose gel electrophoresis)24

 

    3-2.    膠凝體電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresisSDS-PAGE)25

 

    四、    PCR cloning26

 

    五、    大腸桿菌轉化作用(Escherichia coli transformation)26

 

    六、    細菌的培養法26

 

    七、    菌落快速篩選26

 

    八、    限制酶切割作用(restriction enzyme digestion)27

 

    九、    DNA定序及比對分析27

 

    十、    DNA片段純化作用(gel purification)27

 

    十一、    DNA接合反應(ligation)28

 

    十二、    大腸桿菌中質體DNA的製備28

 

    12-1.      小量質體DNA之準備(Miniprep)28

 

    12-2.    中量質體DNA之準備(Hispeed Plasmid Midi kit)28

 

    12-3.      大量質體DNA之準備(Hispeed Plasmid Maxi Kit)28

 

    十三、    DNA酒精沉澱作用29

 

    十四、    細胞株及其培養29

 

    14-1.    細胞繼代培養(subculture)29

 

    14-2.    細胞數目測定29

 

    十五、    DNA轉染作用(transfection)30

 

    十六、    細胞萃取液之製備30

 

    十七、    蛋白質含量測定31

 

    十八、    西方墨點法(Western blot)31

 

    十九、    免疫共同沉澱法(Coimmunpprecipitation)31

 

    二十、    親合層析法(Affinity chromatography)32

 

    二十一、    蛋白質沉澱33

 

    二十二、    二維電泳 (two-dimensional electrophoresis2D)33

 

    二十三、    二維電泳之等電位點聚焦電泳 (Isoelectric focusingIEF).34

 

    二十四、    質譜儀(Mass spectrometry)分析34

 

    二十五、    染色法35

 

    24-1.    Coomassie brilliant blue stain35

 

    24-2.    硝酸銀染色法(Silver stain)35

 

肆、研究結果37

 

    一、    Tid1293T細胞株中過度表現37

 

    1-1.    製備可過度表現 wild type Tid1之質體37

 

    1-2.    製備可過度表現 mutant Tid1之質體37

 

    二、    確認轉染(transfection)wild typemutant Tid1過度表現質體之293T細胞株中Tid1的表現量38

 

    三、    Mutant Tid1喪失和Hsp70結合之能力38

 

    四、    親和層析法(affinity chromatography)找尋和Tid1結合之受質蛋白質38

 

    五、    Tid1蛋白質複合物之膠體電泳分析39

 

    六、    以二維電泳(two-dimensional electrophoresis2D electrophoresis)比較Tid1結合之受質蛋白質39

 

    七、    利用蛋白質體學的方法鑑定和分析和Tid1結合之受質蛋白質40

 

伍、研究討論41

 

陸、表列45

 

    表一、定點突變(site-directed mutagenesis)建造mutant Tid1序列之PCR引子

 

    表二、Tid1受質蛋白之鑑定46

 

    表三、Tid1-LmutTid1-Swt,和Negative control受質蛋白之比較49

 

柒、圖列52

 

    圖一、本論文之研究模型(Working hypothesis)52

 

    圖二、pRK5-Tid1-CHA質體之確認53

 

    圖三、定點突變(site-directed mutagenesis)之流程圖54

 

    圖四、以site-directed mutagenesis做出mutant Tid1之全長55

 

    圖五、TOPO vector攜帶mutant Tid1質體之篩選56

 

    圖六、mutant Tid1核苷酸序列比對57

 

    圖七、已建構完成之mutant Tid1質體之確認58

 

    圖八、Wild typemutant Tid1過度表現質體之Tid1蛋白表現量59

 

    圖九、Wild type Tid1具和mtHsp70結合之能力;反之,mutant Tid1喪失和mtHsp70結合之能力60

 

    圖十、Tid1-Lwt結合之親和性層析管柱的膠質電泳分析61

 

    圖十一、Tid1-Swt結合之親和性層析管柱的膠質電泳分析62

 

    圖十二、Tid1-Lmut結合之親和性層析管柱的膠質電泳分析63

 

    圖十三、Tid1-Smut結合之親和性層析管柱的膠質電泳分析64

 

    圖十四、Monoclonal anti-HA agarose conjugate結合之蛋白質65

 

    圖十五、純化293T細胞株之Tid1-LwtTid1-Lmut蛋白質複合物66

 

    圖十六、純化293T細胞株之Tid1-SwtTid1-Smut蛋白質複合物67

 

    圖十七、純化293T細胞株之monoclonal anti-HA agarose conjugate蛋白質複合物68

 

    圖十八、Tid1蛋白質複合物之膠體電泳分析(I)69

 

    圖十九、Tid1蛋白質複合物之膠體電泳分析(II)70

 

    圖二十、Tid1-LmutTid1-Swt,和negative control三者間結合蛋白質之相同及相異71

 

    圖二十一、Tid1-LwtTid1-Lmut結合之特異性蛋白質的差異72

 

    圖二十二、Tid1-SwtTid1-Smut結合之特異性蛋白質的差異74

 

    圖二十三、Monoclonal anti-HA agarose conjugate結合之非特異性蛋白質76

 

    圖二十四、Tid1Galectin-7之假定研究模型 (Working hypothesis) 77

 

捌、附圖列78

 

    附圖一、Human Tid1 genomic structure. tid112exons組成,被11introns區隔78

 

    附圖二、Tid1核甘酸序列比對(nucleotide sequence)Tid56相似79

 

    附圖三、DnaJ protein藉由其N-terminal的高度保留結構—DnaJ domainHPD loop刺激Hsp70 ATPase活性80

 

    附圖四、監護蛋白(chaperone)蛋白質摺疊過程81

 

    附圖五、pRK5 plasmid map82

 

    附圖六、Point Accepted Mutation25083

 

玖、附表84

 

    附表一、各項溶液配方84

 

拾、參考文獻88