論文名稱:

檳榔子萃取物對人類中性白血球細胞凋亡路徑的影響

 

Effects of areca nut extract on apoptosis pathway in human neutrophils

研究生:

何泳恆  Weng-Hang Ho

指導教授:

洪善  Shan-Ling Hung

學位類別(Degree):

碩士

學校名稱(School):

國立陽明大學

系所名稱(Department):

口腔生物研究所

學號(Student Number):

39517001

學年度(Academic Year):

96

語文別(Language):

中文

出版年(Thesis Year):

97

關鍵字:

檳榔嚼塊  Areca/betel quid

 

檳榔子萃取物  areca nut extract

 

中性白血球  neutrophils

 

細胞凋亡  apoptosis

 

細胞壞死  necrosis

 

白三烯素B4  leukotriene B4

 

糖原合成酶-3  glycogen synthase kinase 3 (GSK-3)

 

磷脂肌醇-3  phosphoinositide-3 kinase (PI3K)

 

活性氧化物  reactive oxygen species (ROS)

全文說明(Fulltext description):

(本論文 20130718 對校內公開)

 

電子全文

  論文頁數(Page):

110

摘要:

嚼食檳榔的習慣流行於世界各地,與牙周病、口腔黏膜下纖維化症和口腔癌等口腔疾病有所關聯。免疫系統中的中性白血球功能異常與於牙周病相關。過去的研究指出,檳榔子萃取物 (areca nut extract, ANE) 可影響中性白血球的存活度和功能。本論文的研究主要探討ANE會否影響中性白血球的細胞凋亡路徑。當ANE處理中性白血球8小時後,利用流式細胞儀偵測Annexin V/propidium iodide (PI)雙染的螢光強度,得知ANE可減少中性白血球的自發性早期細胞凋亡現象,但增加初期細胞壞死的情況。此外,利用西方墨點法探討有關細胞凋亡相關蛋白caspase-3, -8, -9poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 的表現情形,發現當嗜中性白血球以ANE處理過後,會減少caspase-3, -8, -9PARPcleaved form產生。利用流式細胞儀和DNA 瓊脂洋菜膠體電泳等方法,發現ANE減少另一個細胞凋亡之特性-DNA斷裂 (DNA fragmentation) 的產生。ANE處理後可增加中性白血球分泌leukotriene B4 (LTB4) glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) 磷酸化的情形,但LTB4phosphoinositide-3 kinase (PI3K) GSK-3的抑制劑,並不影響經ANE處理的嗜中性白血球早期凋亡、初期細胞壞死與晚期凋亡/壞死的情形,但GSK-3抑制劑可增加經ANE處理的嗜中性白血球中cleaved-form caspase-3的產生。另一方面,ANE處理中性白血球30分鐘後,利用螢光光譜儀可見細胞內活性氧化物 (reactive oxygen species, ROS) 有所增加,而且所增加的ROS可能是透過NADPH oxidase所產生的。而當使用ROS的抑制劑DPI後,並不會影響ANE所減少中性白血球的早期凋亡,但會增加初期細胞壞死的現象。本論文的研究結果顯示,ANE會降低人類中性白血球的自發性細胞凋亡路徑,但增加初期細胞壞死的情形,可能與GSK-3磷酸化的現象有關,但與LTB4PI3K ROS的無關。本論文對於檳榔對嗜中性白血球的影響有進一步的研究,檳榔可能藉由調控嗜中性白血球的死亡路徑而影響口腔健康和發炎反應。

 

 

 

Areca (betel) chewing is a popular habit in the world, and is associated with periodontal diseases, oral submucous fibrosis and oral cancer. Aberrations of neutrophils linked with periodontal diseases have been reported. The previous studies showed that areca nut extract (ANE) affected the viability and functions of neutrophils. This study focused on the effects of ANE on apoptosis pathway in human neutrophils. The results showed that ANE reduced early apoptosis of neutrophils, but increased primary necrosis after 8 h treatment as determined using Annexin V/propidium iodide (PI) staining and flow cytometry. The levels of cleaved-forms of caspase-3, -8, -9 and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) in apoptosis pathway were decreased by ANE as determined using Western blotting analysis. ANE slightly decreased another feature of apoptosis, DNA fragmentation of neutrophils, which was analyzed using agarose gel electrophoresis and flow cytometry. ANE treatment increased the release of leukotriene B4 (LTB4) and induced phosphorylation of glycogen synthase kinase 3 (GSK-3). However, the inhibitors of LTB4, phosphoinositide-3 kinase (PI3K) and GSK-3 did not affect the early apoptosis, primary necrosis and late apoptosis/necrosis of ANE-treated neutrophils. However, the GSK-3 inhibitor could increase cleaved-form of caspase-3 in ANE-treated neutrophils. In addition, the intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) were increased in neutrophils after incubation with ANE for 30 minutes as determined using a fluorometer. Furthermore, the results showed that ANE might increase intracellular levels of ROS through NADPH oxidase. However, the intracellular ROS induced by ANE were not involved in modulation of early apoptotic, but involved in an increase in the primary necrotic cells. These data suggested that ANE may decrease the constitutive apoptosis pathway and increase primary necrosis in human neutrophils. Phosphorylation of GSK-3, but not LTB4, PI3K and ROS, might be involved in the effects of ANE on apoptosis pathway in human neutrophils. Taken together, the results of this study indicated that the influence of areca on oral inflammation may be through the regulation of cell death pathways in neutrophils.

論文目次
Table of Content
:

目錄

 

目錄……………………………………...................………………………………….I

 

圖次目錄......................................................................................................................III

 

中文摘要……………………………………....................……………………………1

 

英文摘要……………..................……………………………………………………3

 

壹、緒論

 

一、    檳榔 (areca nut or betel nut)...............…………………………….5

 

二、    檳榔成分對細胞的影響………….......................…………………………6

 

三、    嗜中性白血球 (polymorphonuclear neutrophils, PMNs).....................7

 

四、    檳榔與嗜中性白血球……………….......................…………………..8

 

五、    細胞死亡 (cell death) 過程…….......................…………………………8

 

六、    細胞凋亡 (apoptosis)………….......................…………………………..9

 

七、    Caspase非依賴性的細胞程序性死亡………......................…………11

 

八、    細胞自噬 (autophagy)………………....................……………….11

 

九、    細胞脹亡或初期細胞壞死………….......................……………...11

 

十、    細胞壞死………………………….......................………………...……12

 

十一、    嗜中性白血球與細胞凋亡現象………………….................…….12

 

十二、    白三烯素B4 (leukotriene B4, LTB4)…………...............…….………13

 

十三、    5-脂氧合酶 (5-lipoxygenase, 5-LO)……................…….……..14

 

十四、    磷脂酰肌醇-3激酶 (Phosphoinositide 3-kinases, PI3K)Akt/protein kinase B (Akt/PKB)…………….....................................……………..15

 

十五、    Glycogen synthase kinase-3 (GSK-3)……................…………..15

 

十六、    嗜中性白血球與依賴氧的殺菌機轉…….................……………….16

 

十七、    活性氧化物 (ROS)................................………………………….17

 

十八、    研究動機………………………................…………………………..18

 

 

 

貳、材料與方法

 

一、    藥物製備……………………..........………………………..19

 

二、    純化嗜中性白血球…………….............…………………………..19

 

三、    細胞存活度的測定……………............…………………………..21

 

四、    蛋白質萃取物的裝備…………..............…………………………..22

 

五、    蛋白質定量 (BCA protein assay)………............………………...23

 

六、    西方墨點法 (Western blotting analysis)............…………….....23

 

七、    螢光染色 (Fluorescence staining)………...................................25

 

八、    酵素免疫方法 (enzyme immunoassay)..........………………..25

 

九、    各抑制劑的處理濃度與時間………..........………………..26

 

十、    細胞凋亡分析

 

甲、    Annexin V/PI雙染法 (Annexin V/PI assay)..................28

 

乙、    DNA 瓊脂洋菜膠體電泳 (DNA agarose gel electrophoresis)…………...............……………………………29

 

丙、    細胞週期與DNA指數分析(DNA content analysis).30

 

十一、    細胞內活性氧化物之偵測……….................……………………….31

 

十二、    統計分析…………………...............………………………………..31

 

 

 

參、結果

 

一、ANE對嗜中性白血球的顆粒度與大小的影響…...................…………32

 

二、ANE對於中性白血球存活度的影響…..................……….……………32

 

三、ANE對於中性白血球的細胞凋亡與細胞壞死的影響...................……32

 

四、探討ANE對嗜中性白血球的細胞凋亡特性-DNA斷裂的研究………………………….........................................................................33

 

五、探討ANE對嗜中性白血球有關細胞凋亡路徑相關蛋白表現的影響…………………………...........................………………...……………34

 

六、利用FLAP抑制劑MK 886探討LTB4是否參與ANE對嗜中性白血球有關細胞凋亡路徑的影響..................................................................35

 

七、利用PI3K抑制劑LY294002探討PI3K是否參與ANE對嗜中性白血球有關細胞凋亡路徑的影響..................................................................37

 

八、利用GSK-3的磷酸化情形以及使用其抑制劑GSK-3 inhibitor X探討GSK-3是否參與ANE對嗜中性白血球有關細胞凋亡路徑的影響...................................................................................................39

 

九、探討中性白血球經ANE處理過後對ROS的影響以及作用..................................................................................................................42

 

 

 

肆、討論……………………….…….....................……………………………..46

 

伍、參考文獻…………………………..........................…………………………92

 

陸、附錄

 

    附表一、ANE對嗜中性白血球於本論文中所探討的影響.......................85

 

附表二、抑制劑與ANE共同處理中性白血球,對ANE作用的影響................................................................................................85

 

附表三、純化中性白血球之溶液配方.................................................86

 

附表四、西方墨點法之溶液配方..............................................................87

 

附表五、免疫螢光染色之溶液配方.......................................................90

 

附表六、抗體………………………...............……………………………....91

 

   

 

 

 

圖次目錄

 

圖一、ANE改變中性白血球大小與顆粒度..............................................53

 

圖二、流式細胞儀偵測以ANE處理8小時對嗜中性白血球存活度之影響..............................................................................................................54

 

圖三、以ANE處理8小時使嗜中性白血球的存活度下降...........................55

 

圖四、ANE改變中性白血球背景螢光值與Annexin V/PI的染色結果..............................................................................................................56

 

圖五、以ANE處理8小時減少中性白血球早期細胞凋亡但增加初期細胞壞死.........................................................................................................57

 

圖六、ANE改變中性白血球細胞核型態...................................................58

 

圖七、嗜中性白血球的細胞週期受到ANE的影響.......................................59

 

圖八、以ANE處理中性白血球後減少細胞期中Sub-G1 phase的細胞數,增加G0/G1 phase的細胞數.....................................................60

 

圖九、ANE使嗜中性白血球的DNA的斷裂情形有輕微的減少...............61

 

圖十、ANE減少中性白血球細胞凋亡相關蛋白的活化態的產生...........................................................................................62

 

圖十一、ANEFLAP抑制劑MK 886中性白血球分泌LTB4之影響.................................................................................63

 

圖十二、FLAP抑制劑MK 886中性白血球存活度的影響............64

 

圖十三、FLAP抑制劑MK 886對於ANE改變中性白血球背景螢光值與Annexin V/PI的染色影響................................65

 

圖十四、FLAP抑制劑MK 886對於ANE改變中性白血球死亡路徑的影響.......................................................................66

 

圖十五、FLAP抑制劑MK 886對於ANE改變中性白血球的細胞週期的影響........................................................................67

 

圖十六、PI3K抑制劑LY294002影響ANE對嗜中性白血球的存活度的影響.............................................................................68

 

圖十七、PI3K抑制劑LY294002對於ANE改變中性白血球背景螢光值與Annexin V/PI的染色影響................................69

 

圖十八、PI3K抑制劑LY294002對於ANE改變中性白血球的死亡路徑................................................................................70

 

圖十九、PI3K抑制劑LY29400對於ANE改變中性白血球的細胞週期的影響........................................................................71

 

圖二十、GSK-3抑制劑GSK-3 inhibitor X對於ANE對嗜中性白血球的存活度的影響.............................................................72

 

圖二十一、ANE使嗜中性白血球的磷酸化GSK-3增加...................73

 

圖二十二、ANE所引起的磷酸化GSK-3,並不受PI3KFLAP抑制劑的影響.......................................................................74

 

圖二十三、GSK-3抑制劑GSK-3 inhibitor X對於ANE改變中性白血球背景螢光值與Annexin V/PI的染色影響.........75

 

圖二十四、GSK-3抑制劑GSK-3 inhibitor X對於ANE改變中性白血球的死亡路徑的影響...............................................76

 

圖二十五、抑制劑MK 886DPILY294002GSK-3 inhibitor XANE減少中性白血球細胞凋亡相關蛋白的活化態產生的影響.........................................................................77

 

圖二十六、ANE處理中性白血球30分鐘後會增加細胞內ROS.........................................................................................78

 

圖二十七、ANE所引起細胞內ROS量上升,能被NADPH oxidase抑制劑DPI所抑制.................................................................79

 

圖二十八、NADPH oxidase抑制劑DPI對於ANE對嗜中性白血球的存活度的影響.....................................................................80

 

圖二十九、抑制劑NAC對於ANE對嗜中性白血球的存活度的影響....................................................................................................81

 

圖三十、NADPH oxidase抑制劑DPI對於ANE改變中性白血球背景螢光值與Annexin V/PI的染色影響................................82

 

圖三十一、NADPH oxidase抑制劑DPI並不影響ANE改變中性白血球的死亡路徑......................................................................83

 

圖三十二、簡圖表示ANE對於影響中性白血球的死亡過程中所扮演雙重角色的可能機制。......................................................84