論文名稱:

副甲狀腺素基因治療對於牙周再生的影響

 

The Effects of PTH Gene Therapy on Periodontal

 

regeneration

研究生:

余嘉仁  Chia-Jen Yu

指導教授:

陳恆理  Hen-Li Chen

學位類別(Degree):

碩士

學校名稱(School):

國立陽明大學

系所名稱(Department):

口腔生物研究所

學號(Student Number):

39417010

學年度(Academic Year):

96

語文別(Language):

中文

出版年(Thesis Year):

97

關鍵字:

副甲狀腺素  parathyroid hormone

 

聚乳酸-甘醇酸  PLGA

 

聚乙烯亞胺  polyethylenimine

 

牙周再生  periodontal regeneration

 

活化基因基質  gene-activated matrix

全文說明(Fulltext description):

(本論文 20100109 對校內公開)

 

電子全文

  論文頁數(Page):

94

摘要:

牙周組織由牙齦、牙周韌帶、牙骨質與齒槽骨所構成。牙周組織常因牙周炎、創傷、疾病感染造成缺損。副甲狀腺素(parathyroid hormonePTH)目前被用於治療骨質疏鬆症,近來研究也顯示可能有助於牙周組織再生。動物實驗中利用活化基因基質(gene-activated matrixGAM)療法給予副甲狀腺素已被證實可促進骨再生,傳統GAM使用膠原蛋白做為基質,機械性質不佳,且其轉染效率仍未達理想,而限制了其應用或療效。本研究的目的在測試以熔融擠製成型(fused deposition modelingFDM)的聚乳酸-甘醇酸(poly ( lactic-co-glycolic acid)PLGA)支架強化GAM的效果;決定用於改善膠原蛋白GAM轉染效率的聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI) 之適當用量;並測試以改良式PTH-GAM局部給予PTH增進牙周再生的效果。本研究在FDM-PLGA支架孔洞內製備膠原蛋白的GAM,形成以PLGA加強機械性質的膠原蛋白GAM。製備含不同PEI-plasmid DNA (N/P ratio= 9,攜帶LacZ 基因) 量的GAM以植入皮下模型測試基因表達,X-gal染色結果發現超過200g DNA之量時其基因表達就無明顯再增加。在六隻狗下顎兩側第二小臼齒近心及遠心側製造一壁(one-wall)牙周缺損,進行牙周再生實驗,將四種不同材料(FDM-PLGA/PTH-collagen GAMFDM-PLGA/LacZ -collagen GAMPTH-collagen GAMLacZ-collagen GAM)以隨機方式置入牙周缺損內,術後四週的免疫組織化學染色結果顯示在局部有PTH表達。在術後四週與八週利用雙能量骨質密度儀(dual-energy Xray absorptiometryDEXA) X光照射分析缺損中骨含量,並進行組織切片檢查,結果證實FDM-PLGA可改善collagen GAM維持再生空間效果不佳的缺點,而藉PTH-GAM基因治療局部給予的PTH也有促進牙周再生的作用。

 

Periodontium is composed of gingiva, periodontal ligament, cementum and alveolar bone. Periodontal defects are often resulted from periodontitis, trauma, and infection. Parathyroid hormone (PTH) is currently being used in treating osteoporosis. Recent studies revealed that it may be also beneficial in periodontal regeneration. Local delivery of PTH via gene-activated matrix (GAM) technology has been known to enhance bone regeneration in several animal studies. The poor mechanical properties with less-than-ideal transfection efficiency of conventional collagen-based GAM often compromise the effect of GAM. The purposes of this study were to 1) Test the reinforcement effct of poly (lactic-co-glcolic acid) (PLGA) scaffold, fabricated by fused deposition modeling (FDM) method, on collagen GAM. 2) Determine the proper dosage of polyethylenimine (PEI) for improving transfection efficiency for collagen GAM. 3) Determine the effect of modified PTH-GAM on periodontal regeneration. Collagen GAMs were prepared in pores of FDM-PLGA scaffold to form PLGA-reinforced collagen GAM (4mm x 4mm x 4mm) in order to improved their mechanical properties. GAMs with different amount of PEI-plasmid DNA  (N/P ratio= 9, with LacZ gene) were prepared and implanted subcutaneously to determine the resulting gene expression. The results from X-gal staining indicated that the gene expression was not increased further when more than 200g of plasmid DNA was used. One-wall periodontal defects were created at mesial and distal sides of mandibular second premolars in six dogs for periodontal regenerative experiment. Four different materials (FDM-PLGA/PTH-collagen GAM, FDM-PLGA/LacZ -collagen GAM, PTH-collagen GAM, LacZ-collagen GAM) were implanted randomly into the periodontal defects. The results of immunohistochemistry after 4 week demonstrated the existence of local PTH expression. Dual-energy Xray absorptiometry and radiography for bone mineral content in the defect, as well as histomorphometric analysis were performed after 4 and 8 weeks.  The FDM-PLGA was able to improve the drawback of collagen GAM in space maintenance. In addition, locally delivered PTH by PTH-GAM gene therapy can enhance the periodontal regeneraton.

論文目次
Table of Content
:

目錄 ……………………………………………………………………Ⅰ

 

圖次目錄 ………………………………………………………………Ⅳ

 

表次目錄 ………………………………………………………………Ⅵ

 

中文摘要…………………………………………………………………1

 

英文摘要…………………………………………………………………3

 

文獻回顧

 

1.    牙周組織的破壞與再生…………………………………………5

 

2.    副甲狀腺素對牙周組織再生的潛力……………………………9

 

3.    活化基因基質……………………………………………………9

 

4.    研究假設與目的 ………………………………………………15

 

實驗材料

 

1.    細胞培養與細菌培養 …………………………………………16

 

2.    試劑與溶液 ……………………………………………………16

 

3.    儀器 ……………………………………………………………19

 

4.    動物實驗耗材、器械及機器……………………………………20

 

實驗方法

 

1.    細胞培養 ………………………………………………………23

 

2.    LB培養液與LB培養基的配製 ………………………………23

 

3.    蛋白質的定量 …………………………………………………23

 

4.    轉染 ……………………………………………………………24

 

5.    100mM IBMX的配製………………………………………… 24

 

6.    單磷酸環狀腺ㄛ〝妠定 ……………………………………25

 

7.    X-gal染色………………………………………………………26

 

8.    小量質體DNA抽取……………………………………………26

 

9.    大量質體DNA抽取……………………………………………27

 

10.    超大量無內毒素質體DNA抽取 ……………………………28

 

11.    抽取細胞RNA  …………………………………………… 30

 

12.    反轉錄-聚合○s鎖反應 ………………………………… 30

 

13.    洋菜膠電泳分析………………………………………………31

 

14.    10mM多聚乙烯亞胺的配製…………………………………32

 

15.    5mM HEPES buffer的配製…………………………………32

 

16.    10% 蔗糖的配製 ……………………………………………32

 

17.    聚乙烯亞胺與質體DNA的混合 ……………………………32

 

18.    聚乙烯亞胺轉染的體外測試…………………………………33

 

19.    鐵氟龍中空立方體模型製作…………………………………33

 

20.    掃描式電子顯微鏡觀察………………………………………34

 

21.    植入兔子皮下測試……………………………………………34

 

22.    組織染X-gal ………………………………………………… 35

 

23.    製作狗下顎無牙脊的步驟……………………………………35

 

24.    活化基因基質的製備  ………………………………………36

 

25.    製作牙周缺損並植入材料的步驟……………………………37

 

26.    收取狗下顎骨標本……………………………………………38

 

27.    組織脫鈣………………………………………………………38

 

28.    蘇木紫-伊紅染色 …………………………………………… 39

 

29.    免疫組織化學染色……………………………………………39

 

30.    X-ray分析 ……………………………………………………40

 

31.    周邊骨質密度測定儀(pDEXA)分析…………………………40

 

32.    組織型態分析…………………………………………………41

 

33.    統計分析………………………………………………………41

 

結果

 

1.    確認pUMVC1-PTH質體DNA ………………………………42

 

2.    pUMVC1-PTH的生物活性測試………………………………42

 

3.    聚乙烯亞胺與質體DNA複合物的製作與測試………………43

 

4.    鐵氟龍模型 ……………………………………………………44

 

5.    以掃描式電子顯微鏡觀察FDM-PLGA/Collagen複合支架與FDM-PLGA支架的結構……………………………………… 44

 

6.    體內測試FDM-PLGA/Collagen攜帶PEI/DNA的理想劑量…

 

…………………………………………………………………44

 

7.    體內測試FDM-PLGA/PTH-Collagen GAM對牙周缺損再生的作用 ……………………………………………………………45

 

  pDEXA檢測結果……………………………………………46

 

  X光片檢測結果 ……………………………………………47

 

    免疫組織化學染色 ………………………………………… 48

 

  組織型態分析 ………………………………………………48

 

討論

 

1.    實驗動物的選擇………………………………………………… 50

 

2.    牙周缺損區的設計……………………………………………… 51

 

3.    改良活化基因基質……………………………………………… 52

 

4.    PLGA-reinforced collagen GAM複合支架結構的討論………53

 

5.    使用聚乙烯亞胺於活化基因基質的製備……………………… 54

 

6.    pUMVC1-PTH(1-34)生物活性之討論…………………………54

 

7.    術後四週與八週標本分析討論………………………………… 55

 

結論 ……………………………………………………………………56

 

圖次目錄

 

    圖一、pUMVC1-PTH的限制﹞尷R……………………………57

 

    圖二、以pUMVC1-PTH轉染細胞後的表現 …………………57

 

    圖三、測試pUMVC1-PTH的生物活性 ………………………58

 

    圖四、冷凍乾燥後的PEI-DNA複合物…………………………58

 

    圖五、測試PEI-DNA在細胞內的表現…………………………59

 

    圖六、鐵氟龍模型 ………………………………………………60

 

    圖七、FDM-PLGAFDM-PLGA/Collagen支架的掃描式電子顯微鏡之圖 ………………………………………………61

 

    圖八、植入皮下模型測試的手術流程圖 ………………………62

 

    圖九、以植入皮下模型測試不同量pUMVC1-LacZ的結果外觀圖

 

          ……………………………………………………………63

 

    圖十、以植入皮下模型測試不同量pUMVC1-LacZ的結果剖面圖

 

          ……………………………………………………………64

 

    圖十一、狗下顎骨兩側的第一小臼齒與第三小臼齒拔牙手術…

 

……………………………………………………………65

 

    圖十二、製造牙周缺損手術 ……………………………………66

 

    圖十三、術後X光片與pDEXA的圖 …………………………67

 

    圖十四、術後四週pDEXA骨含量分析 …………………………68

 

    圖十五、術後八週pDEXA骨含量分析 …………………………69

 

    圖十六、術後四週X-ray分析 …………………………………70

 

    圖十七、術後八週X-ray分析 …………………………………71

 

    圖十八、FDM-PLGA/Collagen GAMCollagen GAM標本外觀的比較 ………………………………………………72

 

    圖十九、拔牙後牙床骨癒合 ……………………………………72

 

    圖二十、FDM-PLGA/Collagen GAM在動物體內的基因表達…

 

…………………………………………………………73

 

    圖二十一、比較四週與八週FDM-PLGA/Collagen GAM的組織圖 ……………………………………………………74

 

    圖二十二、比較FDM-PLGA/Collagen GAMCollagen GAM的組織圖 ……………………………………………75

 

    圖二十三、牙周韌帶的組織圖 …………………………………76

 

    圖二十四、組織型態示意圖 ……………………………………77

 

表次目錄

 

    表一、分析四週與八週不同複合支架空間維持、牙周韌帶與齒槽骨再生的作用 ……………………………………………78