論文名稱:

ANE arecoline 誘導人類口腔鱗狀上皮癌細胞 IEX-1 之研究

 

IEX-1, an immediate early gene, is induced by ANE and

 

arecoline in human oral squamous cancer cells

研究生:

陳信雄  Hsin-Hsiung Chen

指導教授:

夏堪臺  Kan-Tai Hsia

        學位類別:

碩士

        學校名稱:

國立陽明大學

系所名稱:

口腔生物研究所

            學號:

39417006

          學年度:

95

          語文別:

中文

          出版年:

96

關鍵字:

細胞凋亡  apoptosis

 

迅早基因 X-1  IEX-1

 

檳榔子萃取物  ANE

 

檳榔素  arecoline

 

口腔鱗狀細胞癌  oral squamous cell carcinoma

全文說明:

(本論文未授權公開)

        論文頁數:

80

摘要:

根據流行病學資料顯示,口腔癌於台灣男性前十大癌症發生率中,高居第四位。有許多因子可造成口腔癌,在台灣地區則以嚼食檳榔為主因。檳榔子( areca nut )為檳榔嚼塊之主要成分,而檳榔鹼( arecoline )則是檳榔子萃取物( areca nut extract, ANE )的主要物質,ANE arecoline對多種細胞具有細胞毒性以及基因毒性,這些傷害可能造成細胞生長停滯或細胞凋亡,但目前對檳榔是否誘發口腔細胞凋亡及其調控機制瞭解不多。Immediate early response gene X-1 ( IEX-1 ) 是一個可受到多種刺激誘導產生的蛋白質,具有調控細胞增生與細胞凋亡的能力。目前已有研究發現 IEX-1 基因轉殖鼠會發生 T 細胞淋巴癌,但 IEX-1 在口腔癌細胞中所扮演的角色則尚未清楚,另外,ANE arecoline 是否可誘導 IEX-1 的產生而調控對細胞的影響,也尚未了解。因此,本研究目的為了解 IEX-1 ANE arecoline處理下,所誘導的細胞死亡過程中所扮演的角色。實驗首先利用 ANE arecoline 處理口腔癌細胞,觀察 ANE arecoline對口腔癌細胞存活度的影響,發現細胞存活度隨著處理藥物的時間及濃度的增加會有下降情形,此外,發現導致存活度下降的原因為 ANE arecoline 可誘導細胞凋亡發生。之後,實驗以 ANE arecoline 處理口腔癌細胞觀察 IEX-1的表現情形,在 OECM-1 細胞株中,利用 ANE arecoline 處理後可觀察到 IEX-1 mRNA上升,SAS 細胞株也可發現相似現象。利用免疫細胞染色法( immunocytochemistry )亦發現 OECM-1 細胞株受到  ANE 刺激後會在細胞質中表現 IEX-1 蛋白質。此外,ANE  會活化caspase-9 caspase-3PARP 也會被切割,但外生性細胞凋亡路徑中的 caspase-8 則未被活化 。最後利用 IEX-1 的過量表現,觀察 IEX-1 對口腔癌細胞存活的影響。實驗發現,大量表現 IEX-1 的細胞在 ANE 刺激下其細胞凋亡現象會增加。因此綜觀來說,ANE arecoline 會導致口腔癌細胞凋亡,其中 ANE 可誘導內生性細胞凋亡路徑,而 IEX-1 則扮演了促進 ANE 所導致的細胞死亡角色之一。

 

Oral cancer is one of the most frequent malignant tumor in Taiwan, and it ranked as the fourth leading cause of cancer deaths for men. Studies have demonstrated that betel quid chewing is associated with increased risk of oral cancer. Areca nut is the major substance of areca quid, and arecoline is the major ingredient of areca nut. Areca nut extract (ANE) and arecoline have been shown to induce DNA strand breaks and the main cause of cellular transformation and carcinogenesis. However, there was still not clear about whether apoptosis would be caused by areca nut. Since immediate early response gene X-1 ( IEX-1 ) can be induced by a lot of stimulus and furthermore regulate the cell proliferation and cell apoptosis, the specific aim of this study is to investigate the role IEX-1 in apoptosis induced by ANE and arecoline. The results have shown that the cell viability of oral cancer cell lines decreased after the increase of time and dose of ANE and arecoline treatment. The elevation of IEX-1 mRNA was also in accordance with the increase of apoptosis after ANE and arecoline treatment. Furthermore, IEX-1 protein was also found in the cytoplasm of OECM-1cell line after ANE treatment. The activated caspase-9 and caspase-3, cleaved PARP were also found to be induced by ANE.  In conclusion, cell apoptosis induced by ANE and arecoline may be associated with IEX-1 expression.

        論文目次:

目錄......................................................Ⅰ

 

圖次目錄..................................................Ⅲ

 

中文摘要..................................................1

 

英文摘要..................................................3

 

壹、緒論..................................................5

 

  一、口腔癌..............................................5

 

二、口腔癌與檳榔的關係....................................5

 

三、檳榔成分及其致癌性....................................6

 

四、迅早基因 ( Immediate Early Genes, IEGs )..............8

 

五、迅早基因 X1 ( Immediate Early Gene X1, IEX-1 ).......10

 

六、細胞凋亡.............................................13

 

七、研究動機.............................................18

 

貳、材料與方法 ..........................................19

 

一、細胞培養.............................................19

 

二、藥物準備與細胞處理...................................19

 

三、MTT 呈色檢驗法.......................................20

 

四、質體建構( Construction of Plasmid )..................21

 

五、熱休克轉化法( Heat shock transformation )及菌種保存..23

 

六、DNA 定序及比對分析...................................23

 

七、鈣離子轉染( transfection )與建立大量表現 IEX-1 蛋白質之 SAS 細胞株...............................................24

 

八、蛋白質萃取與定量.....................................24

 

九、西方點墨法 ( Western blotting )......................25

 

十、細胞凋亡分析.........................................27

 

十一、反轉錄-聚合酶鏈鎖反應( Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR .....................27

 

十二、免疫細胞化學染色( Immunocytochemistry,ICC )........30

 

十三、統計分析...........................................31

   
 

參、結果.................................................32

 

一、ANE arecoline OECM-1 細胞株存活度的影響........32

 

二、ANE arecoline OECM-1 細胞株細胞凋亡的影響......32

 

三、ANE arecoline OECM-1 細胞株 IEX-1 mRNA 表現的影響.......................................................35

 

四、ANE OECM-1 細胞株 IEX-1 蛋白質在 OECM-1 細胞株中表現位置的影響...............................................39

 

五、ANE OECM-1 細胞株細胞凋亡相關蛋白質表現的影響.....42

 

六、ANE arecoline SAS 細胞株 IEX-1 mRNA 表現的影響.46

 

七、ANE SAS 細胞株細胞凋亡相關蛋白質表現的影響........49

 

八、IEX-1/pcDNA 3.1(-) 表現質體之建構及轉染..............50

 

九、ANE 對大量表現 IEX-1 蛋白質 SAS 細胞株存活度之影響...55

 

十、ANE 對大量表現 IEX-1 SAS 細胞株細胞凋亡的影響........55

 

肆、討論.................................................58

 

一、ANE arecoline 導致 OECM-1 細胞株細胞凋亡之探討....58

 

二、ANE arecoline 影響 IEX-1 mRNA 表現之探討..........59

 

三、ANE 誘導 OECM-1 細胞株 IEX-1 蛋白質表現在 OECM-1 細胞株細胞質之探討.............................................59

 

四、ANE 活化 OECM-1 細胞株細胞凋亡相關蛋白質之探討.......60

 

五、大量表現 IEX-1 SAS 細胞株之探討...................61

 

伍、參考文獻.............................................63

 

陸、附錄.................................................70

 

附表一、初級抗體.........................................70

 

附表二、二級抗體.........................................71

 

附表三、各溶液之配方.....................................72

 

一、免疫細胞染色法的相關溶液.............................72

 

二、蛋白質萃取物的製備相關溶液...........................72

 

三、西方點墨法的相關溶液.................................72

 

圖次目錄

 

圖一、人類 IEX-1 基因啟動子( promoter )區域概略圖解......12

 

圖二、內生性細胞凋亡路徑( intrinsic pathway )與外生性細胞凋亡路徑( extrinsic pathway ) caspase 之調控...............16

 

圖三、在 ANE 的處理下 OECM-1 細胞株的細胞存活柱狀圖......33

 

圖四、在 arecoline 的處理下 OECM-1 細胞株的細胞存活柱狀圖34

 

圖五、在 ANE 的處理下 OECM-1 細胞株的細胞凋亡曲圖........36

 

圖六、在 arecoline 的處理下 OECM-1 細胞株的細胞凋亡曲線圖37

 

圖七、ANE 處理 OECM1 細胞株不同時間後,用 RT-PCR 方式分析 IEX-1 的表現情...........................................38

 

圖八、Arecoline 處理 OECM1 細胞株不同時間後,用 RT-PCR 方式分析 IEX-1 的表現情形....................................40

 

圖九、不同濃度 ANE 處理 OECM1 細胞株後,用 RT-PCR 方式分析 IEX-1 的表現情形.........................................41

 

圖十、OECM-1 細胞株之免疫細胞染色負控制組................43

 

圖十一、以免疫細胞染色法觀察在 ANE 刺激下 IEX-1 蛋白質在 OECM-1 細胞株中表現的位置................................44

 

圖十二、ANE 處理 OECM1 細胞株不同時間後,細胞凋亡相關蛋白質的表現情形...............................................45

 

圖十三、ANE 處理 SAS 細胞株不同時間後,IEX-1 的表現情形..47

 

圖十四、Arecoline 處理 SAS 細胞株不同時間後,用 RT-PCR 方式分析 IEX-1 的表現情形....................................48

 

圖十五、不同濃度 ANE 處理 SAS 細胞株後,用 RT-PCR 方式分析 IEX-1 的表現情形.........................................51

 

圖十六、ANE 處理 SAS 細胞株不同時間後,細胞凋亡相關蛋白質的表現情形.................................................52

 

圖十七、以 PCR 及限制酶切割分析轉型後 E. coli DH5α的質體.53

 

圖十八、轉染 IEX-1/pcDNA 3.1(-) 表現質體進入 SAS 細胞株後, IEX-1 蛋白質表現情形.....................................54

 

圖十九、不同濃度 ANE 處理大量表現 IEX-1 SAS  細胞株觀察細胞的存活度...............................................56

 

圖二十、不同濃度 ANE 處理大量表現 IEX-1 SAS  細胞株觀察細胞的存活度...............................................57