論文名稱:

β–arrestin 2 在口腔鳞狀細胞扮演之角色

 

Role of β–arrestin 2 on oral squamous cell

研究生:

林宜樺  I-Hua Lin

指導教授:

夏堪臺  Kan-Tai Hsia

        學位類別:

碩士

        學校名稱:

國立陽明大學

系所名稱:

口腔生物研究所

            學號:

39417002

          學年度:

95

          語文別:

中文

          出版年:

96

關鍵字:

β–制動素  β–arrestin 2

 

口腔鳞狀細胞  oral squamous cell

 

細胞凋亡  apoptosis

全文說明:

(本論文未授權公開)

        論文頁數:

106

摘要:

  根據行政院衛生署保健處統計,在台灣地區,口腔癌位居男性十大

 

惡性腫瘤發生率排名第四位,而 90% 的口腔惡性腫瘤為口腔鱗狀細胞癌 ( oral squamous cell carcinoma, OSCC )OSCC 的形成一般認為和嚼食檳榔,吸菸等環境因子有關,這些環境因子會直接或間接地造成基因表現的改變,進而促成口腔癌生成。β–arrestin 2為多功能的胞飲接附子 ( adaptor ) 蛋白質,會接上 G 蛋白質的接受器使不敏感化或是內在化,而引起一些訊息傳遞,其中 β–arrestin 2 也會影響細胞的凋亡的傳遞路徑。先前研究發現檳榔子萃取物 ( areca nut extract, ANE ) 可使細胞內的活性氧化物 ( reactive oxygen species, ROS ) 增多,當細胞內的活性氧化物過量時會攻擊 DNA 造成無法修復的傷害,此與細胞的凋亡和癌症的生成有關。因此,本研究目的為探討在口腔鳞狀細胞中,藉由 ANE H2O2 的刺激之下,β–arrestin 2 是否參與調控細胞的凋亡。實驗首先利用組織染色觀察口腔癌組織表現 β–arrestin 2 的情況,結果發現在凋亡細胞的細胞質與細胞核有 β–arrestin 2 的表現,進一步使用 ANE H2O2 刺激口腔癌細胞觀察細胞內 β–arrestin 2的含量,在 mRNA 與蛋白質的表現量上並無顯著差異。但是利用共軛焦螢光顯微觀察受到 H2O2 刺激 OECM-1 細胞株時,則發現β–arrestin 2 會進入到細胞核中。另外,實驗也發現在刺激 H2O2 之後,β–arrestin 2 會和 apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1) 結合。因此,從實驗的結果中可推測,β–arrestin 2 H2O2 刺激 OECM-1 細胞株時,藉由和 ASK1 結合,進一步的影響到細胞凋亡。至於 ASK1 β–arrestin 2 結合後是如何影響到細胞凋亡,則需要更進一步的實驗才可以有更深入的了解。

 

  Oral cancer is one of the most frequent malignant tumor in

 

Taiwan, and it ranked as the fourth leading cause of cancer deaths for men. Studies have demonstrated that betel quid chewing with and without cigarette smoking is associated with increased risk of oral squamous cell carcinoma (OSCC).β-arrestin 2 is a multifunctional endocytic adaptor protein that mediated desensitization and internalization by binding G protein–coupled receptors (GPCRs).Beyond these classical functions, β-arrestin 2 is involved in a growing number of interactions with signaling proteins. This mechanism regulates aspects of cell motility, chemotaxis and apoptosis.Experiments showed that ANE can induce reactive oxygen species (ROS) in various types of cells. Accumulation of ROS causes the breakage of DNA, protein and membranous lipids and results in

 

irreversible cellular damages. These damages are associated with carcinogenesis and apoptosis. The specific aim of this study is to realize the role of β-arrestin 2 in cell death. The immunohistochemical results have shown that the cellular location of β-arrestin 2 in the cancer tissue distribute from nucleus to cytoplasm of apoptotic cells.

 

Furthermore, β–arrestin 2 protein was also expressed in cytoplasm and nucleus of OECM-1 cell line after H2O2 treatment using confocal microscopy. β–arrestin 2 was also found to co-locolize with apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1) by treatment of H2O2. However, the

 

expression of β–arrestin 2 mRNA and protein has no significant change in OECM-1 cell line after ANE and H2O2 treatment. These finding suggest that β–arrestin 2 may have some roles in apoptotic pathway.

        論文目次:

目錄......................................................I

 

圖次目錄.................................................IV

 

中文摘要..................................................1

 

英文摘要..................................................3

 

壹、緒論..................................................5

 

  一、β-制動素Beta-Arrestin 2  ( ARRB2 )..................5

 

二、口腔癌...............................................16

 

三、口腔癌與檳榔之關係...................................16

 

四、口腔癌與香菸之關係...................................17

 

五、檳榔成分.............................................18

 

六、檳榔子水萃取物與活性氧化物之關係.....................19

 

七、活性氧化物...........................................19

 

八、細胞凋亡 ( Apoptosis )...............................21

 

貳、研究動機.............................................26

 

參、材料與方法 ..........................................27

 

一、細胞培養.............................................27

 

二、藥物準備與細胞處理...................................27

 

三、免疫組織染色( Immunohistochemistry , IHC )...........28

 

四、蘇木素和伊紅染色 ( hematoxylin and eosin, H&E )......30

 

五、反轉錄-聚合酶鏈鎖反應(Reverse Transcription-Polymerase

 

Chain Reaction, RT-PCR.................................30

 

六、質體建構( Construction of Plasmid ...................32

 

七、熱休克轉化法( Heat shock transformation )及菌種保存..34

 

八、DNA 定序及比對分析...................................35

 

九、鈣離子轉染技術.......................................35

 

十、免疫細胞化學染色法 ( Immunocytochemistry,ICC ).......36

 

十一、免疫細胞螢光染色法 ( Immunofluorescence, IF )......37

 

十二、蛋白質萃取物的製備.................................38

 

十三、免疫沉澱法( Immunoprecipitation, IP )..............38

 

十四、蛋白質定量 ( Bio Rad Bradford methord )............39

 

十五、SDS-PAGE 製備......................................39

 

十六、西方點墨法 ( Western blotting , WB )...............39

 

十七、細胞凋亡分析.......................................40

 

十八、MTT 呈色檢驗法.....................................41

 

十九、統計分析...........................................42

 

肆、結果.................................................42

 

一、β- arrestin 2 於人類口腔組織的表現...................43

 

二、ANE H2O2 OECM-1 細胞株存活度的影響.............49

 

三、ANE H2O2 OECM-1細胞株細胞凋亡的影響............52

 

四、ANE H2O2 OECM-1 細胞株β- arrestin 2  mRNA

 

    表現的影響...........................................52

 

五、ANE H2O2 OECM-1 細胞株 β- arrestin 2 蛋白質

 

    表現的影響...........................................61

 

六、ANE H2O2 OECM-1 細胞株 β- arrestin 2 蛋白質

 

    表現的位置...........................................61

 

七、H2O2 OECM-1 細胞株影響 β- arrestin 2 ASK1蛋白質

 

    之關係...............................................68

 

八、β- arrestin 2 / pcDNA 3.1(-) 表現質體之建構及轉染....76

 

伍、討論.................................................81

 

一、β- arrestin 2 於人類口腔組織表現之探討...............81

 

二、ANE H2O2 導致 OECM-1 細胞株細胞凋亡之探討.........83

 

三、ANE H2O2  影響β- arrestin 2  mRNA 和蛋白質表現

 

    之探討...............................................83

 

四、ANE H2O2 影響 β-arrestin 2 蛋白質表現在 OECM-1 細胞株

 

    位置之探討...........................................84

 

五、H2O2 OECM-1 細胞株對 β- arrestin 2 影響細胞凋亡關係

 

    之探討...............................................85

 

六、大量表現 β-arrestin 2 OECM-1 細胞株之探討.........86

 

陸、參考資料.............................................87

 

柒、附錄……………………………………………………………………...96

 

附表一、一級抗體..............................................................................96

 

附表二、二級抗體………………………………………………………..96

 

三、免疫組織染色法的相關溶液………………………………………..97

 

四、蛋白質萃取物的製備相關溶液……………………………………..97

 

五、西方點墨法的相關溶液……………………………………………..98