Monoclonal Antibody & Phage Display Lab

L5. Monoclonal Antibody & Phage Display Lab
單株抗體及噬菌體呈現實驗室

實驗室主持人：許萬枝
共同主持人：胡小婷

背景及設立緣由

服務手冊

背景資料

基因定序解碼後為了解新發現基因的表現與否，並研究其功能，一項不可或缺的研究工具就是具備抗原專一性的抗體；專一性抗體可由 (1) 人工合成之peptide 作為抗原產生的具單一性之傳統多株抗體，polyclonal antibody；(2) 單株抗體，monoclonal antibody；(3) 噬菌體呈現抗體的方式產生，phage display。其中，第一種製備方式較為容易，而後兩項的技術層次較高，專一性強，目前本核心實驗室每年能製備十餘種單一性傳統抗體，進行五次左右的融合瘤 (Hybridoma) 實驗，及利用噬菌體呈現方式決定抗原決定區，預期軟硬體擴增後操作容量將增加兩倍，並擬將部分單株抗體之製備以噬菌體抗體取代，以充分支援 S1 及 S3 研究所需。

設立緣由

新發現基因需賦予功能性角色，才有實質意義，故除了部份調控及結構蛋白質的基因外，其他新具備專一性的抗體是證實蛋白質真正表現及細胞分布的最佳利器。

率及藉以帶動發展相關新技術。

檢驗試劑中應用的抗體是一項非常重要的生物技術產品，發現重要的基因後，必須進而分析其蛋白質產物，而這類型的應用必須配合專一性的單株抗體或噬菌體呈現抗體的製備，故本核心實驗室發展之相關技術將是國內生物技術產業中不可或的一環。

藥物的開發，或尋找與大分子結合的物質上扮演重要的角色。

現有基礎

目前國內製備單株抗體可利用兩套由國家衛生院資源網路所提供的免費服務，此外，本核心實驗室也自行製備質體，其基因產物之合成由一 CMV promoter 驅動，另在 -N 端帶有一個 epitope；而辨認該 epitope 所需的單株抗體業已製備完成，該單株抗體能做西方點墨反應 (Western blotting)、免疫螢光染色 (Immuno-fluorescence staining)、免疫沈澱反應 (Immunoprecipitation) 等免疫分析實驗，並已針對兩種不同病源蛋白完成測試。同時，以噬菌體呈現方式決定抗原決定區已是目前本核心實驗室的常規性的操作。

執行方案

研究及服務目標:

製備及改善目前使用之質體。譬如，我們將在質體內Ｃ端加入另一個抗體標示，以便在新基因蛋白產物之抗體尚未製備出來之前，即可把 DNA 片段放入質體內，在細胞中表現後，以現有的兩種抗體一前一後偵測。

在專一性抗體製造方面，未來一年半期間，我們將製備約 20 種單一特性的兔子抗體，這些抗體之抗原均選自新發現的肝癌組織中表現特殊基因，同時，我們將依據累積的相關實驗結果，挑出二至三個抗原進行單株抗體製備。�

發展噬菌體抗體，製備新的噬菌體呈現 peptide library。

新增儀器

Quixell cell selection and transfer system, Manufactured by Stoelting。

此設備之主要功能為單一細胞的純化。融合瘤的成功與否端賴於單株化的過程中是否迅速得到穩定的細胞株，通常第一次篩選陽性但在cloning limiting dilution 後失去了，通常陽性 cell culture wells 的細胞多但族群並不雜； Quixell cell 可以幫助從這些陽性之 cell culture wells 中挑出族群代表性的細胞，提高成功率。

螢光顯微鏡：大規模之基因體計畫開始後，現有之螢光顯微鏡將不敷使用。

空間
現有及增購之設備將存放於國立陽明大學傳統醫學乙棟大樓四樓之 449 及 427 組織培養研究室。

人員
每年將僱用常任助理一名。

經費估算
設備費：

Quixell cell selection and transfer system (Stoelting) (120 萬)，為立即增加融合瘤單株化之效率，擬於第一年採購。

螢光顯微鏡 (約 80 萬)，紓解現有不敷使用之設備，擬於第二年採購。

人事費：助理共四人年 (1*4)，合計 160萬。
耗材費：100 萬/四年

與其他計劃之互動

本核心實驗室將支援計劃中專一性抗體的製備，這些抗體在決定基因產物的功能分析時是不可或缺的工具，它可幫助決定基因所作出的蛋白質在細胞存在的位置、表現時期、蛋白質間互相作用或蛋白質與核酸的作用。本計劃將支援 S1 研究新基因的功能及表現，並配合 S2 選定的蛋白產物製備抗體，噬菌體呈現 peptide library 可與 S5 共同利用，並與 C2、L3、L6 互動如下：

C2 (Gene Expression Analysis Center)
S1 所得資料經 C3 分析得到可能有意義的結果時，本實驗室即可將其 cDNA 裝入我們裝有單株抗體標示的質體，以製備單一性抗體，用來檢測這個基因在細胞中表現的特性。

L3 (Molecular Pathology Lab)
針對 S1 研究的特殊基因群，本實驗室將製備抗體，提供 L3 做組織切片染色，探討其與疾病之間的關係。

L6 (Yeast Genetics Lab)
由酵母菌系統所觀察到蛋白質之間的作用，須進一步以生化，分子生物或其他實驗方式加以證實，本實驗室製備的抗體可以提供免疫沈澱或免疫螢光的分析。除此之外，本實驗室亦將繼續提供常用的單株抗體及質體給國內的學術研究單位，並協助進行特用抗體的製備。

預期結果與成效

與教育課程方面的配合上，本實驗室將支援細胞生物學及發育生物學課程中以專一性抗體作細胞螢光染色，或組織免疫螢光染色，協助了解生物發生、成長的進程中蛋白質表現及移動的情形。在結構生物學上，抗體三度空間的特別結構、及抗原決定點的特殊構造，為教學上的良好教材，另外，在分子醫學及生物技術的課程上，單株抗體及新興的噬菌體呈現仍是重要的課題，本實驗室可支援相關的課程。

設置背景與緣由

基因定序解碼後為了解新發現基因的表現與否，並研究其功能，一項不可或缺的研究工具就是具備抗原專一性的抗體；專一性抗體可由 (1) 人工合成之 peptide 作為抗原產生的具單一性之傳統多株抗體，polyclonal antibody；(2) 單株抗體，monoclonal antibody；(3) 噬菌體呈現抗體的方式產生，phage display。其中，第一種製備方式較為容易，而後兩項的技術層次較高，專一性強，目前本核心實驗室每年能製備十餘種單一性傳統抗體，進行五次左右的融合瘤 (Hybridoma) 實驗，及利用噬菌體呈現方式決定抗原決定區，預期軟硬體擴增後，操作容量將不受學生更替而無法接續，並擬將部分單株抗體之製備以噬菌體抗體取代，以充分支援肝臟病變、肝臟細胞生長、細胞分化、發育、老化、老化後產生相關的疾病、相關藥物的開發等研究所需。並提供教育訓練課程（特別是【分子醫學】及【生物技術學程】）教學實習（講習班）所需。

新發現基因需賦予功能性角色，才有實質意義，故除了部份調控及結構蛋白質的基因外，其他新基因所對應的蛋白質產物其真正的表現程度及細胞內之分布應予進一部分析。

具備專一性的抗體是證實蛋白質真正表現及細胞分布的最佳利器。

有關製備單株抗體及噬菌體呈現抗體的在技術層次較高，必須經由經驗之累積，始能提升操作效率及藉以帶動發展相關新技術。

檢驗試劑中應用的抗體是一項非常重要的生物技術產品，發現重要的基因後，必須進而分析其蛋白質產物，而這類型的應用必須配合專一性的單株抗體或噬菌體呈現抗體的製備，故本核心實驗室發展之相關技術將是國內生物技術產業中不可或的一環。

噬菌體呈現技術已趨成熟，不僅可製備抗體代替物，並可呈現極短的 peptide library，這類技術在藥物的開發，或尋找與大分子結合的物質上扮演重要的角色。

現有基礎
目前國內製備單株抗體使用上可利用國家衛生院資源網路所提供服務，此外，本核心實驗室也自行製備質體，其基因產物之合成由一 CMV promoter 驅動，另在 -N 端帶有一個 epitope，C 端帶有另一 epitope；而辨認該 epitope 所需的單株抗體業已製備完成，該單株抗體能做西方點墨反應（Western blotting）、免疫螢光染色（Immuno-fluorescence staining）、免疫沈澱反應（Immunoprecipiotation）等免疫分析實驗，將針對各種不同來源蛋白進行測試。同時，將以噬菌體呈現方式決定抗原決定區設為本核心實驗室的常規性的操作。
研究及服務目標

製備及改善目前使用之質體。譬如，我們已在質體內Ｃ端加入另一個抗體標示，以便在新基因蛋白產物之抗體尚未製備出來之前，即可把 DNA 片段放入質體內，在細胞中表現後，以現有的兩種抗體一前一後偵測。因為蛋白質性質不同，不同表現的質體常會有不同的效果，因此我們將製備及改進這些質體。

在專一性抗體製造方面，未來每一年，我們將製備約 10-15 種單一特性的兔子抗體，這些抗體之抗原均選自新發現的肝癌組織中表現特殊基因，同時，將依據累積的相關實驗結果，經客觀評估後挑出二至三個抗原進行單株抗體製備。本實驗室也提供校內同仁從事它項研究者技術支援與諮詢，若有特殊情形者也可以個人合作計畫參與。

發展噬菌體抗體，製備新的噬菌體呈現 peptide library。

規劃及特色

儀器

目前仍以傳統 PEG 融合後再以 limiting dilution 方式單株化，將來於 2001 年購入 Quixell cell transfer system 後，再使用該系統來增加效率。
於2002年購入Fluorescence microscope可提供一般經常性螢光染色使用。

空間及人員

本服務目前由許萬枝、王崇義及胡小婷老師實驗室提供，位於傳統醫學乙棟大樓微免所四樓，將聘任一位研究助理負責基本操作。

申請服務須知

I. Polyclonal Antibody Preparation

常用性、共同性高的抗體製備：申請人提出申請後將製備足量，提供日後需求者使用。單次提供 0.1 ml ，不予收費；額外需求者 0.5 ml/1000 NT$。目前有 Glutathione S-transferase、maltose-binding protein、Flag 等 rabbit polyclonal antibodies。
個別性需求抗體：無共同進行合作計畫者，我們可以提供經驗協助其學生或助理，但不代為製造。
操作所需時間: Immunization：6 weeks to 8 weeks。Polyclonal antibodies：these could be done in 2 months on mice (1.5 ml sera about maximum) or rabbits (30 ml sera each animal)。

II. Monolonal Antibody Preparation

常用性、共同性高的抗體製備：單次提供 0.1 ml ，不予收費；額外需求者 0.5 ml/1000 NT$。目前有 Glutathione S-transferase、maltose-binding protein、D-epitope tag 等 Monoclonal antibodies，後兩者可認得七個 amino acids，適合 tagging 的建構 Immunoprecipitation or Western blotting 均合適。
個別性需求抗體：申請人提出申請，經評估有其價值後，申請人自備抗原供 immunization；經兩個月以血清檢測，結果為陽性者可進行第一次融合瘤製備以及後續單株抗體之 ELISA screening，單株化到液態氮約需時程四十天到兩個月，如果需重複第二次融合瘤製備，整個時程須再加長十至二十天，以此類推。若只需腹水，則單獨時程約需二十至四十天。
操作所需時間

Immunization：6 weeks to 8 weeks。

Monoclonal antibodies：by ELISA screening, add 2 months after immunization。

Note：a potential failure of not getting monoclonal antibody of what you want in a single fusion。

III. Epitope Mapping or Mapping Protein Interaction Site with Phage Display

Epitope mapping of monoclonal antibody binding site。
經常性以七個 amino acids 的 peptide library 來定位，時程約需二十天。
Mapping protein interaction site with phage display。
方法與時間與上述 Epitope mapping 相仿。唯蛋白質純化時間不算在內。
Libraries with designed residues：based upon collaboration。
Phage antibodies：under development and not available at this moment。
操作所需時間

Immunization：6 weeks to 8 weeks 4. Ascites: one month is needed to start with frozen hybridoma。

Utilization of phage peptide library：20 days to know the consensus binding sequences。

IV. 預估使用經費，請參照附表。

V. 目前服務能量

每年增加常用性、共同性高的多株抗體 (peptide antibodies) 兩株，Hybridoma fusion 兩次，基本維持經費十萬元，服務能量可以擴張至多株抗體十種，Hybridoma fusion 五次。
VI. 非常規服務之合作研究

Recombinant protein construction and purification。

Preparation of plasmids with eitope tagging。

VII. 其他注意事項
Hybridoma screening 若欲以其他方式取代，必須在 hybridoma fusion 之前建立，screening 時程與困難度亦須另外考慮。
VIII. 負責教授及連絡方法
微生物及免疫學研究所　許萬枝教授
Phone: 28267112; Fax: 28212880
Email: wjsyu@ym.edu.tw
微生物及免疫學研究所胡小婷教授
Phone:28267000 ext. 5622; Fax: 28212880
Email: tingnahu@ym.edu.tw
IX. 技術訓練及推廣活動
每年第二學期開課｛單株抗體與噬菌體呈現｝，每兩年開辦一次工作研討會 (Phage Display Workshop)。