背景資料

截至 1998 年 10 月，人類基因組計劃已完成 200 Mb (人類基因組之 6%) 定序工作。而美國 NIH 及 DOE 新的五年目標，預定於 2001 年完成三分之一之基因組定序 (finished sequence) 及涵蓋 90% 基因組之工作初稿 (working draft)(含 finished sequence)； 人類基因組之全部定序工作則可望於 2003 年完成 (Collins et al., 1998)。更有甚者，美國與英國最近宣佈將提前於 2000 年春季完成人類基因組工作初稿 (Science, March 19, 1999)。目前遺傳學家正極力思考後基因組世代 (post-genome era) 該朝那個方向努力，其中之一便是分析人類基因序列變異 (human sequence variation) 並且探討人類複雜性狀 (complex trait) 之遺傳，以及探討常見非孟氏遺傳疾病 (non-Mendelian disorders) 之遺傳感受性 (genetic susceptibility) (Lander & Schork, 1994; Lander, 1996)。

設立緣由

遺傳因素在常見疾病，例如高血壓、糖尿病、氣喘、及自體免疫疾病中扮演一重要角色。先前我們並無妥善的研究方法可以探討這些遺傳因素，近年來由於人類基因組計劃快速進展，使我們有機會應用「全基因組搜尋」之基因定位方法找尋相關之致病基因。

人類基因組科技之研發帶動了分子醫學之新紀元，也建立人類遺傳學研究之新趨向。目前許多遺傳學家正致力於人類序列之變異 (human sequence variation) ，以求深入探討疾病之遺傳風險因素和人類族群之遷徙。人類基因序列之變異以 SNP (single nucleotide polymorphism) 最為常見。由於 SNP 之偵測可以自動化，加上分佈極為普遍，SNP 已成為 DNA 標記之明日之星。David Wang 等人於 1998 年發表運用 gel-based sequencing 加上 DNA chips 技術檢查 2.3 Mb 區域之 SNP。他們總計找出 3241 個 SNP，並建構以 2227 個 SNP 為基礎之遺傳圖譜。此外，他們更進一步證實 DNA chip 作為大量分析 SNP 之可行性。

除了 DNA chip 外，Denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) 已被應用於基因序列變異之偵測。此項技術主要在比較兩個染色體上序列之差異，透過將 PCR 產物 denature 及 reanneal 步驟，分析樣品在 denaturing 條件下在 HPLC 分離成 heteroduplexes 或 homoduplexes，DHPLC 技術已被應用於 Marfan Syndrome (Liu et al., 1998)、Factor X 基因 (O'Donovan et al ., 1998)、及 PTEN/MMAC1 之突變分析 (Yokomizo et al., 1998)。

現有基礎

過去數年來，本校及教學醫院 (台北榮總) 致力於人類遺傳學研究並逐步建立基因定型分析 (genotyping) 之研究能力。陽明 (榮總) 校 (院) 區現有五部 ABI PRISM 377 可供使用，其中兩部 (放置於榮總教研部) 已配有 Genescan 及 Genotyper 軟體；一部 (放置於榮總皮膚部) 有舊版軟體，另外兩部 (放置於陽明實驗大樓 B 區) 從事基因定序用，目前尚缺 Genescan 及 Genotyper 軟體。

具體目標

本核心設施將整合陽明、榮總現有之研究資源，支援現行之研究工作並擴大規模，針對單基因疾病進行全基因組搜尋 (whole-genome search)，或對多基因疾病進行已知染色體位置之關連研究 (association study) 或全基因組搜尋。

執行方案

• 採購設備及放置地點

台北榮總現有三部 ABI PRISM 377 可供使用，其中兩部 (放置於教研部， 編號甲)；一部 (放置於皮膚部，編號乙)，另外陽明大學兩部 (放置於實驗大樓B區，編號丙)。
甲: 增加配屬 PCR 機器。
乙: 由 32-lane 昇級為 96-lane；更新軟體。
丙: 增加配屬 PCR 機器；購置軟體。

另外為建立有效找尋 single nucleotide polymorphism (SNP) 之能力，將採購 Transgenomics 之 WAVE 系統兩套，置於陽明大學實驗大樓四樓B區臨床醫學研究所。WAVE 系統應用 denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) 比較兩染色體所放大之 DNA 片段，可在局部分解條件  (partially denaturing conditions) 下依留置時間 (retention time) 之差異分離 heteroduplexes 與 homoduplexes (Unerhill et al., 1997)。使用與 column 連線之 UV detector, DHPLC 可分析將近 1 kb 之 DNA 片段。由於 WAVE 系統可自動化操作，而成本較 DNA 定序便宜，這項儀器已成為偵測 SNP 之新利器。

人員
   甲組：雇用三人從事儀器操作。
   乙組：雇用一人從事儀器操作。
   丙組：雇用三人從事儀器操作。
 
• 常規工作
1. 運用已獲得之基因組序列，進行功能基因 (functional genes) 之多樣性分析，找出 SNP。
2. 有計劃性建立序列多樣性 (SSTR，SNP) 於國人族群之基本資料庫。

1. C1: 找出之致病基因座 (disease gene loci) 將委由定序中心 (C1) 作進一步定序；找出之 SNP 將委由 C1 以定序確認。
2. C3: 資料庫之維護與相關軟硬體之支援。
3. 支援 Scientific Program

本核心設施主要將支援 S2 (Genetic Susceptibility to Human Diseases) 之研究。 針對顯性遺傳疾病 Cutaneous lichen amyloidosus，多基因疾病 Type2 Diabetes 及 Autoimmune Disease 之遺傳因素加以分析。
4. 與國內其他單位之合作
• 將配合國衛院基因組周玉山博士建立之 Mapping Panel，訂定國人最佳之 markers 組合。
• 將與東華大學合作：針對特定人類染色體區域進行定序；尋找 SNP；並共同研發 DNA 晶片。

設置背景與緣由
 

截至 1998 年 10 月，人類基因體計劃已完成 200 Mb (人類基因體之 6%) 定序工作。而美國 NIH 及 DOE 新的五年目標，預定於 2001 年完成三分之一之基因體定序 (finished sequence) 及涵蓋 90% 基因體之工作初稿 (working draft) (含 finished sequence)；人類基因體之全部定序工作則可望於 2003 年完成 (Collins et al., 1998)。更有甚者，美國與英國最近宣佈將提前於 2000 年春季完成人類基因體工作初稿 (Science, March 19, 1999)。目前遺傳學家正極力思考後基因體世代 (post-genome era) 該朝那個方向努力，其中之一便是分析人類基因序列變異 (human sequence variation) 並且探討人類複雜性狀 (complex trait) 之遺傳，以及研究常見非孟氏遺傳疾病 (non-Mendelian disorders) 之遺傳感受性 (genetic susceptibility) (Lander & Schork, 1994; Lander, 1996)。

遺傳因素在常見疾病，例如高血壓、糖尿病、氣喘、及自體免疫疾病中扮演重要角色。先前我們並無妥善的研究方法可以探討這些遺傳因素，近年來由於人類基因體計劃快速進展，使我們有機會應用「全基因體搜尋」之基因定位方法來找尋相關之致病基因。

人類基因體科技之進展帶動了分子醫學之新紀元，也建立人類遺傳學研究之新趨向。目前許多遺傳學家正致力於人類序列之變異 (human sequence variation) ，以求深入探討疾病之遺傳風險因素和人類族群之遷徙。人類基因序列之變異以 SNP (single nucleotide polymorphism) 最為常見。由於 SNP 之偵測可以自動化，加上分佈極為普遍，SNP已成為 DNA 標記之明日之星 (Weiss, 1998; Zhao et al., 1998)。 David Wang 等人於 1998 年發表運用 gel-based sequencing 加上 DNA chips 技術檢查 2.3 Mb 區域之 SNP。他們總計找出 3241 個 SNP，並建構以 2227個 SNP 為基礎之遺傳圖譜 (Wang et al., 1998)。此外，他們更進一步證實 DNA chips 做為大量分析 SNP 之可行性。 最近 Lai 等人亦完成了 APOE 基因、涵蓋 4 Mb 區域之 SNP 遺傳圖譜 (Lai et al., 1998)。

除了 DNA chip 外，Denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) 已被應用於基因序列變異之偵測。此項技術主要在比較兩個染色體間序列之差異，透過將 PCR 產物 denature 及 reanneal 步驟，分析樣品在 denaturing 條件下在 HPLC 分離成 heteroduplexes 或 homoduplexes 所造成之滯留時間 (retension time) 差異。 DHPLC 技術已被應用於 Factor X 基因 (O'Donovan et al ., 1998) 及 PTEN/MMAC1之突變分析 (Yokomizo et al., 1998)。

規劃及特色

本核心設施將整合陽明、榮總現有之研究資源，支援現行之研究工作並擴大規模，針對單基因疾病進行全基因體搜尋 (whole-genome search)，或對多基因疾病進行已知染色體位置之關連研究 (association study) 或全基因體搜尋。

過去數年來，本校及教學醫院（台北榮總）致力於人類遺傳學研究並逐步建立基因定型分析 (genotyping) 之研究能力。本核心設施將以台北榮總教學研究部現有之 ABI PRISM 377 為主。另將增加配屬 PE9700 PCR 機器二部，及電腦分析系統一套。

另外為建立有效找尋 single nucleotide polymorphism (SNP) 之能力，將採購Transgenomics 之 WAVE 系統壹套。WAVE 系統應用 denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) 比較兩染色體所放大之 DNA 片段，可在局部分解條件 (partially denaturing conditions) 下依留置時間 (retention time) 之差異分離 heteroduplexes 與 homoduplexes (Underhill et al., 1997)。使用與 column連線之 UV detector, DHPLC 可分析將近 1 kb 之 DNA 片段。由於 WAVE 系統可自動化操作，每個工作天可處理 180 樣本；加以成本較 DNA 定序便宜，這項儀器已成為偵測 SNP 之新利器。

雇用助理一人從事儀器操作、判讀及輸出。
本核心設施另聘請國衛院周玉山博士擔任研究顧問。

申請服務須知
 

I. 大小介於 90~370bp 之微衛星標記 (microsatellite marker) 基因型定型 (genotyping)

• 申請人應提供之材料與資訊：
1. 品質良好之 genomic DNA (可穩定進行 PCR)。濃度：20ng/microL。份量：每人每一標幟需 5 microL。如果 DNA 品質不佳 or PCR 設計不良，則份量依失敗率遞增。
2. 需訂定之基因座 (locus) 數目。
3. 每個基因座之 PCR 引子對 (primer pair)，其中一個 5 端螢光標幟。濃度：100 microM。份量：至少 100 microL。
4. 與 PCR 相關之完整資料，如：引子序列，螢光種類，PCRoptimization 之資料 (gel picture)，預期之產物大小，對偶基因 (alleles) 大小之分布範圍圪等。

• 申請人預期得到之服務成果：

對偶基因大小以鹼基對 (bp) 表示。

• 操作所需時間：

請由目前服務能量估計，再多加 8~12 週協調確認時間。

• 預估使用經費，請參照附表。

 
• 服務能量：

目前服務能量平均每天 64 個基因型，如果基因標幟可彼此配合於同一電泳 lane 中。註：64 個基因型可為一個人的 64 個基因座或 16 個人每人 4個基因座。若有多於一個計畫使用本常規服務，則每個計畫之速率依計畫數遞減。如有至少 5 位全職助理及足夠的實驗室空間；則可達最大服務量 320/天 個基因型。

II. 不屬於常規服務之合作研究：

任何需要超過壹小時的討論或"動腦"之工作，如：PCR 條件之調整、基因座的挑選、數個基因座之配合設計、表格設計、統計分析圪等，不屬於常規服務。合作研究請事先連絡 (鍾明怡 28712121 ext. 3265 or 林明薇 28712121 ext. 3634)。超出服務能量時，視實際狀況，再做安排。

III. 連絡人及連絡方法

Dr. Ming-yi Chung  鍾明怡     臺北榮民總醫院教學研究部
臺北市北投區 112 石牌路二段 201 號
TEL: 02-28712121 ext. 3265
e-mail: mychung@vghtpe.gov.tw

Dr. Ming-Wei Lin  林明薇     臺北榮民總醫院教學研究部，流行病與生物統計研究室
臺北市北投區 112 石牌路二段 201 號
TEL: 02-2871-2121 ext. 3634
e-mail: mwlin@vghtpe.gov.tw