背景資料

近年來，遺傳工程已被廣泛應用，特別是人類基因組之整理分析 (Human Genome Project)，已成為生物醫學研究之有效利器。由於分子醫學之進展，許多與人類疾病有關 (包含癌症之基因)，大量被鑑定出來；而基因序列之完整解碼，將有助於基因認定 (Gene Identification)、染色體結構分析、與疾病遺傳因素之探討，增加研究工作者對各種生理及病裡現象的了解。人類基因組的定序將於公元 2003 年完成，屆時人們面對的挑戰將是如何分析這數萬個基因的表現及其功能，故功能性基因組研究 (Funtional Genomics Study) 將是下一個世紀生物醫學的重點。

本中心著眼於這個未來的發展趨勢及需求，配合本計畫之其他核心設施及實驗室，在現有之基礎上規劃分析基因表現之各類型軟硬體設備 (如圖 C-5)，其中尤其著重於微陣列 (MicroArray; Schena et al., 1998) 技術的引進，並與本校醫學工程團隊合作，進一步開發與此類技術相關之功能性模組 (Funtional Module)。

 

圖 C-5：基因表現分析中心之實驗設計及相關設施規劃

微陣列技術可將欲偵測之 DNA 植株轉印至玻片或其他薄膜上，作為雜交反應之模板，用來快速鑑定或定量不同標本中基因群組成之不同（圖 C-6）。

為配合微陣列實驗，增加標本純化之程度及效率，本中心亦規劃採購一套組織選取儀器 Laser Captured Microdissection (LCM)；同時，也將利用 Real Time Quantitative PCR 技術來分析或量化組織中特定基因之表現。在基因產物 (蛋白質) 之量化分析 (Quantification) 及細胞組織定位 (Localization) 方面，我們將擴充或升級現有之共軛焦點顯微影像系統 (Confocal Imaging System) 及流速細胞篩選分析系統 (Flow Cytometry)，希望就基因表現之各個面相，作系統性之探討 (見圖 C-5)。

設立緣由

1. 為了研究基因在細胞或組織中之表現，本中心將設立微陣列分析系統，利用 DNA 雜交反應 (Hybridization) 及螢光偵測方式，同時分析上萬個基因的轉錄表現。微陣列分析有兩個最主要的好處：(1)可以平行處理大量的基因數據來比較不同組織間或比較生理及病理變化時基因群組表現之差異。 (2) 微陣列實驗只需要非常少量的組織標本或試劑 (Chen et al., 1998; Schena et al., 1998; Ermolaeva et al., 1998)。目前，微陣列之製備主要有兩種方式，其一為利用半導體光罩技術作核甘酸原位合成 (in situ synthesis; Fodor et al., 1993; Chee et al., 1996)；譬如，Affymetrix 公司生產之晶片可在 1.6 cm²面積上合成 400,000 種不同的寡核甘酸。我們將與東華大學與交通大學的團隊合作，共同研發這個技術。另一類微陣列製備方式是將已有之 DNA 精確的點放在微陣列的狹小區域中 (microspotting; Schena et al., 1996, Chen et al., 1998)，這些 DNA 通常來自純化的植株 (Clones)。我們將在本中心設立以這類微點觸 (Microspotting) 為主的微陣列系統。
2. 先前本校為執行國科會尖端計劃，已於校內建立分子細胞遺傳學 (L2) 及具有百萬鹼基定序能力 (C1) 之實驗室，為配合分析相關基因產物之表現程度及細胞內之分佈與代謝之研究，我們已於 1996 年分別購置共軛焦點顯微影像系統及流速細胞篩選分析系統，成立初步之功能性基因組研究設施，具備良好成效，然校內校外對此類技術之需求與日俱增，原先規劃之容量已不敷使用，故擬利用本「追求卓越」計劃進一步擴大規模，以配合國家級基因組研究中心之需求為目標。
3. 本中心亦規劃採購 Real time quantitative PCR 以作為基因表現量化分析的輔助工具，同時，我們將配合 CA6 核心實驗室購置一套組織選取儀器 Laser Captured Microdissection，以強化微陣列實驗中，標本純化之效率。
4. 本中心規劃之特色為：集中發展 (從不同層面，以不同技術分析基因之表現)，採用最新科技 (包含新技術之引進及現有設備之升級)，人材培訓及技術推廣 (我們已於 1998 及 1999 連續兩年舉辦相關之基因組分析工作研習會)，永續經營 (人類基因組定序完成後尚有許多基因表現及功能性題材有待分析，為求穩定發展必需尋求核心幹部之工作保障，並將核心設施納入研究機構之編制。其餘人員則以約僱任用，以保彈性與活力)。

現有基礎

1. 在微陣列設施方面，我們目前有一套自行搭配組裝之微陣列系統，利用玻璃微電極作為點列工具，並以螢光原位雜交方式偵測，目前正在進行安裝自動化操作。然而，當初這部第一代微陣列系統之裝置容量以千點以內之微陣列為目標，並不適合大量基因群之分析，但在自行裝置微陣列設施的過程中，已累積許多珍貴的經驗。配合自行研發及改進現有之微陣列，我們計畫在本計畫中購置一套適合大量基因群分析之微陣列系統。
2. 我們於 1996 年購置共軛焦點顯微影像系統 (Leica TCS NT confocal microscope, Leica Microsystems Heidelberg GmbH)，在兩年內提供校內校外研究工作者超過兩千五百工作小時的服務，是研究細胞或組織顯微影像不可或缺之利器，成效卓著。 當初購置這套共軛焦點顯微影像系統時由於經費限制，只有包括一組雷射及兩個偵測光路，其裝置功能及容量已不敷使用，故擬在本計畫中升級為兩組雷射，多重偵測光路，及具備強組織穿透能力之雙光子成像系統 (Two-Photon Imaging System)，已配合下個世紀之需求流速細胞篩選分析系統 (Flow cytometry system)。
3. 我們目前擁有二部可供螢光輔助細胞篩選分析 (fluorescence assisted cell sorting; FACS) 用途之流速細胞分析儀 (flow cytometer)，分別是 FACSort 及 FACS Vantage (Becton-Dickinson)，其中 FACS Vantage 配有三組雷射 (488 nm、633 nm 及 UV)，並裝置 Turbo Sort 模組，可做十種顏色快速分析。FACSort雖亦具篩選功能，惟目前僅作掃描式分析之用。在使用之推廣方面，除每年度第二學期由解剖所宋晏仁老師及微免所謝世良老師聯合開授之「流速細胞篩選儀在生物醫學研究上之應用」課程外，寒暑假亦均舉辦講習會。FACSort 自 1994 年購置至今，已累積超過 2000 小時之始用量，平均每日將近使用 2 小時；自 1999 年起，更由解剖所技士提供上機服務，嘉惠更多原本不諳此項技術但又需要使用之研究生及教授。由於 FACSort 已漸老舊，加上使用人數漸增，擬於本計劃中更新 FACSort 之雷射管及細胞流管路系統，並添購一部與 FACSort 同級之掃描用細胞儀 (預計為 FACS Calibre)，以提供基因表現功能性狀之快速及大量之分析。
4. 為配合微陣列實驗，增加標本純化之程度及效率，本中心亦規劃採購一套組織選取儀器 Laser Captured Microdissection，這套裝置可在顯微鏡下，利用紅外線激化原理，在微米解像力之範圍內做組織細胞分離，做為微陣列及其他分子遺傳實驗之標本前置處理。
5. 同時，我們也將利用 Real time quantitative PCR 技術來以分析或量化組織中特定基因之表現。

具體目標

• 設定微陣列基因表現分析之操作流程 (圖 C-7)。
1. 裝置微陣列之微點觸 (Microspotting) 系統。
2. 裝置微陣列之螢光訊號偵測系統。
3. 自動化及最佳化 (Optimization)。

• 升級並擴充現有共軛焦點顯微影像系統之功能及操作容量
1. 安裝及測試激發雷射光源及微細裂縫式螢光分頻系統 (Slit-based fluorescence channel system)。
2. 安裝及測試雙光子成像系統。
3. 設定標準操作流程 (Protocols)。

• 升級並擴充現有流速細胞分析系統之功能及操作容量
1. 置換 FACSort 之雷射管及已瀕廢損之管路及電路控制系統，並更新控制系統運作之電腦系統及軟體，除加強運用新版軟體之較靈活操控功能外，擬使電腦能連結目前校園內 100 MB/sec 之網路傳輸，以便使用者直接將資料回傳到期實驗室儲存。
2. 購置 FACS Caliber 級之掃描用流速細胞分析儀一部，以供基因體計劃功能性分析之大量需求。
3. 加強訓練現有操作 FACSort 之專任技士，以增進服務容量及品質。
4. 訓練並聘請碩士級以上之專任人員，專司 FACS Vantage 之操作，俾能發揮該儀器之強大分析篩選功能，服務基因體計劃之可能需求。

• 增設 LCM 裝置並設定標準操作流程。

 
• 增設 Real time quantitative PCR 裝置並設定標準操作流程。

 

 
 

執行方案

   研究目標

• 基因表現分析中心之微陣列常規運作項目有兩項 (圖七)：
1. 與 CA1 合作，針對肝癌組織之 cDNA library，做大量植株定序 (圖七，白色箭頭)，由此產生之 EST 植株，可用來製備肝癌之 EST 微陣列；然後以此 EST 微陣列為模板，分析臨床肝癌標本之基因表現。
2. 將肝癌或周邊正常組織之 cDNA library 植株，直接製備成微陣列 (圖七，黑色箭頭)，針對臨床肝癌標本加以分析，得到有趣之植株後再交由 CA1 完成定序及基因認定工作。

• 基因表現分析中心之共軛焦點顯微影像系統常規運作項目有：
1. 配合 S1 有關肝生理及病理之研究，探討肝細胞及組織之結構與功能 (詳見 S1-D 部份)。
2. 配合 CA9 之抗體製備，做特定基因產物在細胞及組織分布及定位 (Localization) 之研究 (詳見 CA9 部份)。

• 基因表現分析中心之流速細胞分析系統常規運作項目有：
1. 配合 CA5 有關細胞遺傳學之研究，做染色體之流速篩選與分析。
2. 配合 CA9 之抗體製備，做特定基因產物表現程度之研究。

•  LCM 之常規運作為: 提供微陣列及其他分子遺傳實驗之標本前置純化處理 (圖 C-5)。

 
• Real time quantitative PCR 裝置之常規運作為: 配合並確認微陣列之分析結果 (圖 C-5)。

1. 微陣列設備之裝設預定於 1999 年採購壹部，2000 年完成自組機台的自動化，並與本校醫學工程團隊合作，繼續這項技術的研發。
2. 共軛焦點顯微影像系統預定於 1999 年完成第一階段之升級與擴充 (包含激發雷射光源及多頻裂隙式螢光偵測系統)，預定於 2000 年完成雙光仔系統之裝設。
3. 流速細胞分析儀設備部份，FACSort 之更新擬於 1999 年 12 月前完成，而 FACS Caliber 之採購擬於 2000 年 4 月前完成，加入服務陣容。
4. 預定於 1999 年完成評估並採購壹部 LCM，其機型及特性與 CA6 擬採購之機型不同且功能互補。
5. 預定於 2000 年完成評估並採購壹部 Real time quantitative PCR 裝置。

1. 微陣列設備將放置於實驗大樓 B 區 325 室。
2. 共軛焦點顯微影像系統將放置於傳統醫學乙棟大樓 317 室。
3. 流速細胞分析儀之空間規劃如下：FACS Vantage 目前置放於傳統醫學大樓乙棟 327 室，FACSort 目前置放於實驗大樓 B112 室。新購入之 FACS Caliber 亦將置放於實驗大樓 B112 室。
4. LCM 設備將放置於實驗大樓 B 區 327 室。
5. Real time quantitative PCR 將放置於實驗大樓 B 區 327 室。

將僱用博士級常任研究人員兩名，研究助理四名。另外，流速細胞分析儀 FACSort 目前由解剖所技士蕭校生先生及余玉英小姐負責上機服務 (余員亦負責電子顯微鏡之上機服務)，FACS Caliber 將仍由此二名技士負責。FACS Vantage 因操作技術相當複雜，必須另聘請一名碩士級以上之專職人員負責。

• 微陣列設備:

Arraying Apparatus (commercial model) 500 萬
Arraying Apparatus  (self-assmbly) 100 萬
Scanning Apparatus  (commercial model) 500 萬
Scanning Apparatus  (self-assmbly) 100 萬
 
• 共軛焦點顯微影像系統

Current System
• Upgrade to Slit-Based Optical Path 100 萬
• Additional Laser Source 100 萬
• Additional PMT detectosfor 100 萬
New System
• Two Photon-Based 1000 萬
• 流速細胞分析儀將與 L11 幹原細胞採集分離實驗室共同採購。

 
• LCM 設備將與 L3 分子病理學實驗室共同採購。

 
• Real time quantitative PCR 500 萬

與其他計劃之互動

本中心將與 C1 及 C3 展開密切合作，其互動關係為本中心常規執行方案的基礎（請見圖 C-7 及 C1、C3部份)。與 L1、L2、L3、L4、L5 彼此之互動關係如下：

L1 (Genotyping Lab)
由 C1 及 L1 所獲得之基因定列，將可利用微陣列分析方式，尋找 SNP，並製作基因晶片，進行大規模分析。由 L2 所訂定之基因組標的，將由 C1 進行定序。

L2 (Molecular Cytogenetics Lab)
微陣列可將標的基因群作成模板，提供分子細胞遺傳學之實驗操作；譬如，利用 cDNA library consortium 之微陣列代替染色體作為雜交模板，可大幅提升基因組雜交比對實驗 (CGH) 之解像力至單一基因。此外，利用共軛焦點顯微鏡可增加各類型分子細胞遺傳學實驗之解像力及精密度。

L3 (Molecular Pathology Lab)
本中心採用之 LCM 技術著重 Laser catapultion。
 

設置背景與緣由

人類基因體定序工作預計將於公元 2003年完成，屆時，人們面對的挑戰將是如何分析這(十)數萬個基因的表現及其功能，故功能性基因體研究 (Functional Genomic Study) 將是下一個世紀生物醫學的重點，本核心設施將針對功能性基因體研究，規劃設置相關之軟硬體設備。本中心規劃之特色為：集中發展 (從不同層面，以不同技術分析基因表現)，採用最新科技 (包含開發及引進新技術)，人材培訓及技術推廣 (舉辦相關工作研習會)。

1. MicroArray(Scanning)

為了研究基因在細胞或組織中之表現，本中心將與人腦探索卓越計畫合作，設立微陣列 (MicroArray) 分析系統，利用 DNA 雜交反應 (Hybridization) 及螢光，呈色反應或放射性偵測等方式，平行處理大量的基因數據來比較不同組織間或比較生理及病理變化時基因群組表現之差異（請見圖一)。人腦探索卓越計畫將規劃設置以微點觸 (Microspotting) 為主的微陣列系統，而本中心將在初期架設微陣列螢光掃描儀，以供資料讀取 (註：可適用於大部分市場提供之螢光型微陣列玻片)。

2. Gene Subtraction Studies

A modified version of the subtractive hybridization method originally designed by Clontech Laboratories, Inc. (PNAS 93: 6025-6030, 1996) will be used to isolate differentially expressed genes in particular cell types or tissues.  Two sets of RNA derived from different cells or tissues are needed as starting materials.  It is a PCR-based cDNA subtraction method, which could selectively amplify target cDNA fragments (unique genes) and simultaneously suppress nontarget DNA amplification.  In addition, this method includes a hybridization step that normalizes sequence abundance during the course of subtraction by standard hybridization kinetics, therefore overcomes the problem of low abundance of target genes.  The PCR fragments thus generated are cloned into a TA vector (Invitrogen) to make libraries.  Clones that contain inserts are selected for sequencing and sequence information is analyzed through gene database searching and comparison (the latter two need to use C1 Sequencing Core and C3 Bioinfomatics Core).

3. Localization and functional studies

Various microscopy
From conventional transmission light microscopy (bright field, dark field, phase, contrast, DIC or Normaski), fluorescence microscopy, to video-enhanced time-lapsed microscopy are all available.  Specific focuses are on various living cell microscopy, including calcium and various vital tracking, organelle labeling, and various GFP and related tagging methodologies.

Confocal Microscopy
為配合分析相關基因產物之表現程度及細胞內之分佈與代謝之研究，我們於 1996 年購置共軛焦點顯微影像系統 (Leica TCS NT confocal microscope, Leica Microsystems Heidelberg GmbH)，目前已累積近三千工作小時，提供校內校外相關技術與服務，成效良好。我們將配合「追求卓越」計劃，增購新一代共軛焦點顯微影像系統 (Leica SP2)，配置雙光子膜組 (Two-Photon Module)，以增加訊號雜訊比及組織穿透深度，並安裝多重偵測光路，進一步提供各項顯微影像服務。

Functional assays:
Time-lapsed recording, calcium imaging, organelle tracing, various tagging methods, and in vitro assays (such as in vitro motor activity).  Contact us for more details

   服務相關之研究發展

本中心尤其著重於分析基因表現之相關方法學，預計於 2000 年夏天前測試完成 SAGE/TALEST 技術，開始建立有關肝正常與病理組織之資料庫。並將與台北榮總及本校蛋白體學研究人員合作，於最短時間內成立二維蛋白質電泳分析之標準操作步驟，以納入本中心之服務。而利用各類型顯微操作從事之活細胞與組織的功能性研究更是本中心的特色之一，如胞器動態攝影 (organelle vital dye tracing)、鈣離子攝影 (calcium imaging)、綠色螢光蛋白質標記 (green fluorescence protein tracing)、紅外線雷射光鉗 (laser tweezers) 等，相關研發及合作請洽本中心。

• MicroArray Scanning

位於實驗大樓 A332 室，已裝設一組 GSI GENETAC 2000 玻片掃描儀 (2000 年 3 月)。此儀器一次最多放置 24 片玻片。目前有兼任技術員一名。預定聘請一位專任技術員。
 
• Gene Subtraction Study

本服務目前由范明基老師實驗室提供，位於護理大樓之神經科學研究所，擁有操作相關實驗之各項儀器將聘任一位研究助理負責本項服務。

• Localization and Functional Studies

本服務目前由林奇宏老師實驗室提供，位於傳統醫學大樓乙棟之微生物暨免疫學研究所，主要儀器為各式顯微影像及數位影像系統，將聘任一位研究助理負責基本操作。

申請服務須知

  I.  MicroArray Scanning 微陣列玻片掃描

       一、服務原則

1. 以目前之人力，本中心將提供一次三小時，每週三次的服務，待專任人員到職後每週可增至八次服 務)。
2. 服務對象以追求卓越計劃之參與研究室為第一優先，所有玻片將由本中心代為掃描。若被服務者有額外需求，可派遣一位專人前來本中心受訓，以裨自行進行掃描工作。非追求卓越計劃之單位，亦可申請掃描服務，惟服務次數以一個月四次為上限。若需服務次數頻繁，本中心將負責訓練該單位之專人一員，以協助掃描工作之執行。
3. 申請人請於要求服務前三天與負責人聯絡，以便排定服務執行時間。急件最遲需於前一日下班前連繫，恕不接受當日服務之要求。

• 申請人應提供之材料
1. 欲掃描之玻片，玻片上請加以編號。
2. 所使用之螢光名稱、矩陣範圍、矩陣示意圖、陽性對照組位置及相關資料 (將提供表格供參考)。
3. Zip 100 磁片一至數片 (formatted for PC)，視所掃描範圍及玻片數而定。

• 申請人預期得到之服務成果
1. 三組掃描影像，包括一組自動曝光，二組調整曝光之結果。
2. 螢光強度示意圖 (需申請者告知所感興趣的區域)。ps. 此圖並非資料分析結果，乃相對之訊號強弱。

• 操作所需時間
1. 單次服務以三小時為上限，應可掃描 24 至 48 片玻片。
2. 實際所需時間依訊號強弱會有調整。

• 資料分析

掃描資料之進一步分析，將以 collaboration 方式進行。
 
•  預估使用經費，請參照附表。

       三、連絡人及連絡方法

             李玲慧：2826-7000 轉 5512 或 5163

       四、技術訓練及推廣活動
             視實際需要將彈性舉行儀器操作訓練及分析軟體應用之講習。
             以上之各項規定將視實際執行狀況加以修正。
             申請人若有任何意見也請立即反應給負責人員，以利改進。
 

II. Gene Substraction

一、服務須知

• 申請人應提供之材料與資訊
1. 欲從事細胞或組織之名稱及其他基本相關資訊。
2. 10 ug 的兩組樣品 total RNA 或 mRNA。其 OD260/OD280 ratio 需在 1.8 以上。並提供樣品在 1.5% DNA agarose gel 的 patterns 以確定 RNA 品質。
3. 每單次服務以不超過六個樣品為原則。
• 申請人預期得到之服務成果
1. 兩組含有 300~500 colonies 之 libraries。每一 library 並有 10 個 colony insert size 的 gel picture。
2. TA cloning 之 ligation product。此可供作實驗者進一步 transformation 之用。
• 操作所需時間

請務必預約，每單次服務需十四個工作天。將依當時之 workload 依序儘快完成。

• 預估使用經費，請洽連絡人。

• 目前服務能量

每週可完成兩個樣品服務。系列實驗工作請事先與本中心連絡，以利安排。

二、負責人及連絡方法

神經科學研究所 副教授 范明基
Tel: 28267184; Fax: 28200259
Email: mjfann@ym.edu.tw

三、技術訓練及推廣活動
不定期開辦工作研習會 (Workshop) 及 RNA 抽取技術的訓練課程。

III. Localization and Functional Studies

一、服務須知

• 申請人應提供之材料與資訊
1. 欲從事細胞或組織內定位之蛋白質或分子名稱及其他相關資訊。
2. 利用免疫螢光染色或其他螢光染劑完成固定、染色等步驟之標本 (請使用本中心提供之標準操作程序)。
3. 每單次服務以不超過六個標本 (載玻片) 為原則。

• 申請人預期得到之服務成果
1. 蛋白質或分子於細胞或組織內之分佈及相對分佈量。
2. 影像圖檔可以不同數位格式 (TIFF，PICT等) 儲存或傳送。
3. 本中心亦提供基礎分析軟體。

• 操作所需時間

請務必預約，每單次服務將於三工作天內完成。

• 預估使用經費，請洽連絡人。

• 目前服務能量

每週可從事兩次預約服務。系列實驗工作請事先與本中心連絡，以利安排。

• 非常規服務之合作研究，包含下列各項:

活細胞影像
Time-lapsed recording
Vital dye/GFP-tag living cell microscopy
Calcium imaging
Laser tweezers
Micorinjection, etc.

二、負責人及連絡方法

微生物及免疫學研究所 副教授 林奇宏
Tel: 28267219; Fax: 28212880
Email: linch@ym.edu.tw

三、技術訓練及推廣活動
     每學年第二學期開課｛影像技術在生命科學研究之應用｝
     不定期開辦工作研討會 (Workshop) 及相關技術訓練課程。