背景資料

基因組定序為人類基因組計劃 (The Human Genome Project, HGP) 之重大目標。基因組序列之完整解碼，將有助於基因認定 (gene identification)、基因調控 (gene regulation)、人類變異 (human variation)、染色體結構分析、與疾病遺傳因素之探討。

過去數年來，基因組定序 (genome sequencing) 已成為開發生物學研究新領域之利器。TIGR 首先以 total genome shotgun方式完成 H. influenza Rd 之全基因組定序，此先例使基因組定序蔚為風潮，目前已有將近二十種微生物基因組序列存在於資料庫。酵母菌基因組定序於 1996 年完成；C. elegans 全部基因組序列則於 1998 年 12 月公佈 (Science, Dec. 1998)。

隨著下一世紀之即將來臨，人類基因組定序工作亦進入一嶄新階段。1998 年 10 月發表之美國人類基因組計劃新的五年目標 (New 5-Year Goals) 宣示將於 2003 年完成人類基因組全部定序工作。此外 HGP 亦將於 2001 年底前先行完成人類基因組三分之一的完整定序工作，以及其他區域之工作初稿序列 (working draft sequences)。這兩者 (finished sequences and working draft sequences) 將涵蓋人類基因組之九成。除了政府支持之研究計劃外，另外有兩家公司亦將投入全人類基因組之初稿定序。相對於前者採用以殖株為基礎 (cloned-based) 之定序，後者將採全基因組隨機定序 (whole-genome shotgun sequencing) 之策略。我們預期這兩種方式將可互補：前者所獲得之完成序列可提供後者作為固著點 (anchor points)；而後者所產生之初步基因序列資料將可為前者所吸收採納。

本校自 1997 年完成人類肝臟 EST 序列之初步資料庫 (Tsai et al., in preparation) 後即著手建立基因組定序實驗室。所選定之染色體目標為人類第四號染色體 4q24 及第十六號染色體 16q22。 這兩個區域先前已採用 LOH mapping (Yeh et al., 1996)及 CGH analysis (Chen et al., in preparation) 發現有遺傳物質缺失 (deletion) 因而推測可能藏有與肝癌致病有關之抑癌基因 (tumor suppressor gene)。依據上述基因定型分析 (genotyping) 與細胞遺傳學研究之結果，我們先行選定位於 4q24 上 D4S421- D4S411 間大約 2 cM 之片段作為目標。截至目前，已完全八個 BAC 之定序，總計獲得約 1 Mb 之序列 (Chang et al., in preparation)。此項成果在亞太地區佔領先地位，僅次於日本。由於人類第四號染色體之定序工作僅有 Stanford University 投入而其成效並不甚理想 (Science, May 8, 1998)； 加以本土之肝癌臨床與基礎研究皆深具基礎，因此本項研究計劃極具國際競爭力。

設立緣由

先前本校為執行國科會尖端計劃，已於校內建立具有百萬鹼基定序能力 (Megabase Sequencing) 之實驗室，為強化此項能力，本「追求卓越」計劃擬進一步擴大規模，使之成為國家級之定序中心，全部完成後預期總年產量可達 25Mb。
 
1. 立足台灣，放眼世界。

Genome Projects 為世界性學術研究活動，在台灣發展基因組定序需量力而為，但也需達到中大規模( 年產量 20-40 Mb；五年內貢獻 100-200 Mb 以上)，方能為國際所重視。
 
2. 集中發展。

基因組定序為基因組研究之火車頭，具有先導與指標之作用。然而基因組定序所費不貲，為達到國際水準必需集結資源、重點發展。以上述目標而言，核心設施必須擁有三到五組　ABI PRISM3700 新型定序儀。
 
3. 採用最新科技。

ABI PRISM 3700 係針對 production sequencing 而生產。高度自動化之設計可減少人力需求，方便管理。新系統具有較高之靈敏度，可以減少 reagent 之需求量。(目前 reagent 佔 running cost 之 57 %)。目前全世界已有 400 units ABI PRISM 3700 訂單，其中日本有 60 units；中國大陸有 2 units。 為免輸在起跑線上，台灣必須取得最新科技，以求保持在亞太地區之領先地位 (僅次於日本)。
 
4. 人材培訓。

目前已建立基因組大量定序之研究團隊，genome sequencing 之前後兩端皆能銜接。因此加入新的 sequencer 將可顯著提高sequencing 產能。
 
5. 長遠規劃。

本地之研發水準離科技大國尚有一段距離，如果未能洞燭機先、預為籌劃，而只一味模仿，終將苦於落後大截。目前已規劃進行小鼠對應染色體區域 (syntenic region) 之定序，將可找出演化保留序列並研究染色體結構。
 
6. 廣為普及。

基因組及 cDNA 定序為生物醫學研究之最新利器。為充份發揮影響，本核心設將協助訓練小規模基因組定序 (100 kb 到 500 kb)，或接受代工，執行 50kb 到 100 kb 之定序計劃，或 2500 株以上之 EST 定序計劃。
 
7. 永續經營。

人類基因組定序完成後尚有許多生物題材有待分析，為求穩定發展必須尋求核心幹部 (2 Ph.D., 2 head technicians) 之工作保障，並將核心設施納入研究機構之編制。其餘人員則以約僱任用，以保持彈性與活力。

現有基礎

目前已有二部 ABI PRISM 377，並有研究團隊數人，每月可完成基因組定序約 150 kb，年產量在 1~2 Mb之間 (Chang et al., in preparation)。先前並已建立 EST定序能力 (請參考http://www.nhri.org/)。

具體目標

1. 進行人類正常肝臟及癌化肝臟之 EST 定序。
2. 支援 S1 小鼠基因組定序，完成 30Mb 序列。
3. 支援 S1 研究題材，完成 25,000 EST。
4. 支援 S2 研究題材，進行基因組定序 (此項計劃將與東華大學合作)。
5. 支援 S5 研究題材，進行 Cytochrome P450 核酸序列變異分析。

執行方案

  研究目標: 基因組定序中心之常規研發展計劃有兩項：

1. 小鼠基因組定序—未來四年內完成 30 Mb。
2. 小鼠 EST定序—未來四年內完成 25,000 筆 EST。

將收集不同時期之小鼠肝臟並針對研究題材 (regeneration，fibrosis，carcinogenesis，hematopoiesis，drug reaction) 製作基因庫，進行 EST 定序。

  其他支援設備: network，PCR，centrifuge，automatic dispenser 等等。

  空間: 將放置於實驗大樓 B 區 320 室。

  人員: 將僱用博士級常任研究人員兩名，研究助理四至八名。

  經費估算

基因組定序：每個鹼基需定序試劑新台幣四元。
EST 定序：每個反應新台幣兩佰元。

與其他計劃之互動

本計劃將支援 S1 研究中小鼠動物模式之 cDNA 基因定序及基因組大量定序。此外將與 C2、C3、L1、L2、L4 相互配合（如圖三），彼此之互動關係如下：
 
 

C2 (Gene Expression Analysis Center)
由定序實驗室 (C1) 所獲得之 cDNA 殖株將交由 Gene Expression Analysis Center 製作 Microarray，分析其基因表現之程度及特性。

C3 (Bioinformatics Center)
C1 定序實驗室所獲得之基因組及 cDNA 序列，將由 C2 加以分析登錄，每兩週更新一次，並適時對國內外公佈。

L1 (Genotyping Lab)
由 C1 所獲得之基因序列，將可尋找 SNP，並製作基因晶片，進行大規模分析。由 L1 所找出之染色體目標區域，將由 C1 進行定序。

L2 (Molecular Cytogenetics Lab)
由 L2 所獲得之染色體目標，將由基因組定序中心進行大規模定序。基因組定序之 BAC 執株委由 L2 以 FISH 方法確認染色體位置。

L4 (Mouse Genetics Lab)
Mouse Genetics Lab 之首要目標為針對人類第四號染色體 4q22-24 區域之小鼠 (三及五號) 染色體進行計劃性剔除 (systemic knock out)。由 C1 所分離之 BAC Clones 及小鼠基因組定序將有助於設計 knock out constructs。

除此之外，C1 將支援陽明校內及校外大規模之定序需求，接受委託之條件為：
1. 超過 50Kb 之基因組目標。
2. 超過 2500 株之表現基因 (cDNA) 定序。
與東華大學合作部份 (預算由東華大學統一編列)：
• 將為東華大學之追求卓越計劃執行 10 Mb 之人類基因組定序。
• 上述基因組序列將由東華大學之追求卓越計劃製作 DNA chip，以進行 SNP 偵測。

預期結果與成效

預計於 1999 年每季完成 5 個BACs； 2000 年每季完成 10 個 BACs； 2001 年每季完成 15 個 BACs；2002 年每季完成 20 個 BACs；2003 年每季完成 25 個 BACs。至 2003 年7 月計劃結束時累計將完成 235 個 mouse BACs 之基因組定序，如以平均 120 kb 計，預估將完成 25-30 Mb 定序工作。此項成果之意義有三：首先，由於美國在小鼠基因組定序目前僅投入 10% 之經費，而預定完成之日期亦較人類基因組慢兩年 (Collins et al., 1998)，因此本核心設施針對人類四號染色體之基因組定序 (由國科會尖端計劃支援) 及對應小鼠三號及五號染色體之定序 (由本追求卓越計劃支持) 將會有顯著之貢獻 (如圖四)。再者，由於我們集中資源針對人類及小鼠對應區域 (syntenic regions)，預期於 2003 年完成各 30 Mb 之基因組序列，將可從事演化上之比較。三者，S1 子計劃亦將結合 L4 (Mouse Genetic Lab) 進行小鼠三號及五號染色體區域之系統性大段剃除 (systemic deletion of large chromosome segments)，以探討此染色體區域內基因之功能。整合基因組定序與小鼠遺傳 (mouse genetics) 兩種研究途徑，將充分發揮定序中心核心設施之功能。

Milestones for 1999

August         Project starts
                     Set up WWW site
                     Register to HGSI (Human Genome Sequencing Index)
October    First 3700 installed
December   5 BACs sequenced

March          15 BACs sequenced
June             25 BACs sequenced
                     Press release after 1 Mb done
September   35 BACs sequenced
October        Second 3700 installed
December    45 BACs sequenced

March         60 BACs sequenced
June            75 BACs sequenced
September  90 BACs sequenced
October       Third 3700 installed
December   105 BACs sequenced

March        125 BACs sequenced
June           145 BACs sequenced
September 165 BACs sequenced
December  185 BACs sequenced

March      210 BACs sequenced
June         235 BACs sequenced
July          Project ends

設置背景與緣由

基因組定序為人類基因組計劃 (The Human Genome Project, HGP) 之重大目標。基因組序列之完整解碼將有助於基因認定 (gene identification)、基因調控 (gene regulation)、人類變異 (human variation)、染色體結構分析、與疾病遺傳因素之探討。過去數年來，基因組定序 (genome sequencing) 已成為開發生物學研究新領域之利器。The Institute for Genomic Research (TIGR) 首先以 total genome shotgun 方式完成 H. influenza Rd 之全基因組定序 (Fleischmann et al., 1995)，此先例使基因組定序蔚為風潮，目前已有將近二十種微生物基因組序列存在於資料庫。 酵母菌基因體定序於 1996 年完成 (Goffeau et al., 1996); C. elegans 全部基因體序列則於 1998 年 12 月公佈 (The C. elegans Sequencing Consortium, 1998)。隨著下一世紀之即將來臨，人類基因體定序工作亦進入一嶄新階段。1998 年 10 月發表之美國人類基因組計劃新的五年目標 (New 5-Year Goals) 宣示將於 2003 年完成人類基因體全部定序工作 (Collins et al., 1998)。此外 HGP 亦將於 2001 年底前先行完成人類基因組三分之一的完整定序工作，以及其他區域之工作初稿序列 (working draft sequences)。這兩者 (finished sequences and working draft sequences) 將含蓋人類基因體之九成。除了政府支持之研究計劃外，另外有兩家公司 (Incyte and Celera) 亦將投入全人類基因體之初稿定序。相對於前者採用以殖株為基礎 (clone-based) 之定序，後者將採全基因體隨機定序 (whole-genome shotgun sequencing)之策略。我們預期這兩種方式將可互補：前者所獲得之完成序列可提供後者作為固著點 (anchor points)；而後者所產生之初步基因序列資料將可為前者所吸收採納。最近，美國之 National Human Genome Research Institute (NHGRI)與英國之 Sanger Center 更進一步將 working draft sequences 之目標日期提前 18個月，將於 2000年春天完成。此項新的進展對人類基因體研究已產生極大之衝擊 (Science, March 19, 1999)。

著眼於目前需求及未來發展趨勢，並配合本中心其他核心設施及核心實驗室，我們將在既有基礎上規劃大規模定序 (large scale sequencing)。

1. Genome sequencing
2. EST sequencing

  Sequencing-based HLA typing

規劃及特色

著眼於目前需求及未來發展趨勢，並配合本中心其他核心設施及核心實驗室，我們將在既有基礎上規劃大規模定序 (large scale sequencing)，主要分為兩大類： (1) Genome sequencing 及 (2) EST sequencing ，並具有以下特色：集中發展 (由專任助理操作)，採用最新科技 (包含開發及引進新技術)，人材培訓及技術推廣 (舉辦相關工作研習會)。

申請服務須知
 

I.  Genome Sequencing
 
1. 申請人應提供之材料
• BAC，PAC，Cosmid Clones 及相關資訊。
• Purified phage insert DNA (大於15 kb，至少 10 mg) 及相關資訊。
• 每單次服務以不超過二個標本為原則。


2. 申請人預期得到之服務成果

• 10 X covered contig sequence。
• Simple text file for each contig sequence。


3. 操作所需時間

• 如執行順利，每個執株需六週時間。
• 實際安排時程依計畫優先順序訂定。


4. 預估使用經費，請參照附表。

5. 目前服務能量: 每年 20 個殖株。
 

II. EST Sequencing
 
1. 申請人應提供之材料
• plasmid subclones in 96-well microtiter plates。
• 每單次服務以至少 300個標本為原則，最多以 1000 標本為限。


2. 申請人預期得到之服務成果

• 平均 500 bp per read。
• Simple text file for each clone。


3. 操作所需時間

• 如執行順利，每次服務需一週時間。
• 實際安排時程依計畫優先順序訂定。


4. 預估使用經費，請洽負責人。

5. 目前服務能量: 每年 30,000 殖株。
 

III. 連絡人及連絡方法